简介：摘要目的构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别< 0.001、< 0.001、= 0.001、= 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。

简介：摘要随着社会经济的进步，居民生活水平不断提高，电力需求日益多元化。为此，变电系统的稳定与安全性，备受关注。目前，虽然我国变电检修工作取得了显著成就，但依然存在一些客观问题。基于此，本文主要论述了变电检修中，SF-6开关常见问题及其应对措施，希望对我国变电检修发展有帮助。

简介：摘要目的制备靶向转铁蛋白受体（TfR）的多肽分子探针99Tcm-组氨酸-精氨酸-脯氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-组氨酸（简称99Tcm-T7），并评估其在荷瘤裸鼠模型micro SPECT/CT显像中的效果。方法采用间接标记法，在共配体N-三（羟甲基）甲基甘氨酸和乙二胺二乙酸的协同下，制备99Tcm-T7。采用流式细胞术测定人胰腺癌PANC-1细胞和人乳腺癌MX-1细胞表面TfR的表达水平，采用体外细胞结合及细胞竞争抑制实验评估99Tcm-T7体外结合TfR的亲合力及特异性。构建荷瘤裸鼠模型，注射99Tcm-T7后进行micro SPECT/CT显像及生物学分布实验。采用离体组织放射性磷屏自显影成像及组织病理学检查，观察TfR的表达情况。2组间的比较采用独立样本t检验。结果成功制备了分子探针99Tcm-T7，其标记率>95%，分别在与生理盐水、胎牛血清的混合液中孵育4 h后的放射化学纯度为（95.3±0.3）%和（90.6±0.4）%。流式细胞术实验结果显示，PANC-1细胞与TfR单克隆抗体的结合率为（98.9±0.1）%，而MX-1细胞与TfR单克隆抗体的结合率为（0.2±0.1）%。体外细胞结合实验结果表明，PANC-1细胞与99Tcm-T7共孵育60 min后结合率达到峰值[(16.12±0.01)%]，高于MX-1细胞[（1.20±0.01）%]，且二者间的差异有统计学意义（t=28.67，P<0.001）；细胞竞争抑制实验结果表明，PANC-1阻断组与99Tcm-T7的结合率降低至（2.40±0.01）%，与PANC-1实验组的差异有统计学意义（t=26.91，P<0.001）。荷瘤裸鼠体内micro SPECT/CT显像结果显示，99Tcm-T7可从血液中迅速清除，主要通过肾脏排泄。PANC-1荷瘤裸鼠模型在注射99Tcm-T7后30 min时肿瘤轮廓显示清晰，肿瘤/肌肉比值达2.80±0.22。生物学分布实验结果显示，肿瘤及各脏器对99Tcm-T7的摄取[每克组织百分注射剂量率（%ID/g）]与显像结果一致，且99Tcm-T7在PANC-1细胞中的摄取[（0.55±0.18）%ID/g]高于MX-1细胞[（0.16±0.11）%ID/g]，差异有统计学意义（t=6.42，P<0.001）。放射性磷屏自显影结果显示，在注射99Tcm-T7 30 min后，相较于MX-1细胞，PANC-1细胞显著摄取99Tcm-T7 ；在正常组织脏器中，以肾脏摄取最为显著，其次为肝脏。苏木精-伊红染色法及免疫组织化学染色法结果显示，肿瘤实质内未见明显坏死，在PANC-1细胞中TfR呈高表达，而在MX-1细胞中TfR呈低表达。结论成功制备了靶向TfR的特异性多肽分子探针99Tcm-T7，其在荷瘤裸鼠模型中具有良好的显像效能，有望为在体监测肿瘤TfR的表达提供新的影像学手段。