简介：摘要目的考察不同胰蛋白酶及消化后是否弃去胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞消化效果的影响，并评价培养基中添加胎牛血清对减轻胰蛋白酶细胞毒性的作用。方法选用5种胰蛋白酶分别消化MDCK细胞，消化5 min后弃去胰蛋白酶为弃去组，不弃去为保留组。观察消化过程，记录细胞达到不同状态所需的时间。完全消化后，检测细胞的活率、结团率、直径。以不同浓度的胰蛋白酶消化MDCK细胞，按培养基是否添加胎牛血清分为含血清和无血清组，检测细胞活性。结果重组胰蛋白酶消化时间长于动物源胰蛋白酶。保留和弃去组细胞活率均值都大于94.77%，结团率均值均大于34.56%，直径均值分别为17.33和16.97 μm且差异有统计学意义(t＝4.632, P<0.001)。细胞活性随胰蛋白酶添加量呈现梯度变化。含血清和无血清组的细胞活性差异有统计学意义(t＝12.545, P<0.001)。结论5种胰蛋白酶均可完全解离贴壁MDCK细胞，其中重组胰蛋白酶消化时间较长，作用温和，比较适合生产。弃去胰蛋白酶再继续消化的做法可行且有益，胰蛋白酶浓度对细胞活性有影响，胎牛血清可以减轻胰蛋白酶的潜在毒性。

简介：摘要目的构建表达甲型H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza A virus，H5N1 AIAV)NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒，为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)编码基因，并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tiantan，VTT)于Vero细胞中发生同源重组后，筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒(rVTT-HA/NA)，并对其进行鉴定。结果反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp，与预期相同。DNA测序证实，改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明，HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示，rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性，血凝滴度为1∶32。结论重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。

简介：摘要膜蛋白是与细胞膜磷脂双分子层结合的蛋白质，在生命活动中具有重要作用，也是重要的药物靶点。为了解膜蛋白生化反应的机制和设计新的药物靶点，膜蛋白的纯化方法显得尤为重要。完整的膜蛋白疏水性较强，在膜裂解过程中容易形成沉淀，复杂的纯化工艺会导致膜蛋白回收率较低，并且膜蛋白本身在天然宿主中低表达。因此，选择不仅能高效提取膜蛋白，还能保持膜蛋白分子天然空间结构和理化性质的纯化方法十分重要。此文主要对膜蛋白的提取、去污剂的选择、膜蛋白的纯化、去污剂的去除等方面的研究进展进行概述。

简介：摘要目的比较H1N1流感病毒疫苗株在MDCK和MDCK-G1细胞中的最佳培养条件、产毒量、病毒滴度和细胞代谢情况。方法通过棋盘法摸索两种细胞的最佳种毒条件，然后比较2株细胞在最佳条件种毒后的血凝滴度、半数组织感染剂量(TCID50)、葡萄糖和乳酸的代谢情况。结果MDCK-G1细胞以感染复数(MOI)＝0.001、1 μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后，72 h时血凝滴度达到峰值(1∶512)，病毒滴度为107.4TCID50/ml；MDCK细胞以MOI＝0.000 1、1 μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后，72 h时血凝滴度达到峰值(1∶256)，病毒滴度为106.6TCID50/ml。结论MDCK-G1比MDCK细胞更适合流感病毒的增殖。本研究为细胞基质流感疫苗的研究提供了参考数据。

简介：摘要目的建立流感疫苗神经氨酸酶分离纯化方法，并制备神经氨酸酶定量检测参考品。方法制备对神经氨酸酶具有特异亲和力的功能化磁粒，建立基于该磁粒分离纯化神经氨酸酶的方法，优化分离纯化条件，对分离纯化的神经氨酸酶进行纯度分析和特异性验证，并进行酶活性测定和蛋白质定量。结果成功制备4-氨基苯草氨酸修饰的功能磁粒，建立基于该磁粒分离纯化神经氨酸酶方法，分离纯化神经氨酸酶纯度为98.7%，从H1N1、H3N2、B/Victoria和B/Yamagate 4种疫苗单价原液分离纯化的神经氨酸酶蛋白质浓度分别为71.50、100.58、64.11和37.68 μg/ml，且均保留酶活性。结论建立了分离纯化流感病毒神经氨酸酶方法并制备了相应参考品。

简介：摘要目的制备重组流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)三聚体蛋白疫苗并进行相关表征分析，研究重组HA三聚体在小鼠模型中的免疫原性。方法构建稳定表达HA三聚体蛋白的CHO细胞株，通过Western blot、单向免疫扩散试验、蛋白质粒径检测和N-糖基化位点分析对重组蛋白进行定性及定量分析。根据剂量、佐剂等处理条件的不同将BALB/c小鼠分为11个组，并进行一致的免疫程序。初次免疫后56 d检测血清中和抗体效价，以评价免疫原性。结果构建的CHO细胞株能够分泌表达HA三聚体。HA三聚体具备生物学活性能够在单向琼脂免疫扩散试验中形成沉淀环，蛋白质粒径大小约为18.79 nm，具有10个N-糖基化位点，包括高甘露糖型、复合糖型和杂合糖型；HA三聚体重组蛋白疫苗在2次免疫小鼠后，3.75 μg剂量配伍RFH01佐剂与对照组单价疫苗原液15 μg引起的中和抗体效价差异无统计学意义(P＝0.431 2，U＝36)，配伍佐剂组免疫后血清抗体效价均高于未加佐剂组，其中15 μg HA三聚体+RFH01组效价最高，为1 280。结论成功制备了流感病毒重组HA三聚体蛋白，其与RFH01佐剂配伍能够诱导BALB/c小鼠产生针对流感病毒的体液免疫应答，为流感病毒重组亚单位疫苗的研发提供了参考。

简介：摘要目的在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中，通过IPTG诱导，在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白，验证表达的准确性，Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白，多剂次免疫家兔，获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时，重组蛋白免疫BALB/c小鼠，评价其免疫原性。结果rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体，可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体，可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原，在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体，可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。