简介:以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动_GFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究.结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和人肝癌细胞系HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到GFP表达.Hepa1-6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍.G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1/2.转染入肝癌细胞系HepG22周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达.其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA801中表达.以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性.
简介:目的:利用磁珠富集法分离北柴胡微卫星序列,以开发北柴胡微卫星引物,获得有多态性的简单序列重复(SSR)标记。方法:用生物素标记的混合探针(AC)15、(AG)15、(MAB)12:和两端连接已知序列人工接头的北柴胡基因组DNA酶切片段混和后与磁珠杂交,构建微卫星序列富集的小片段插入文库;利用接头引物分别与生物素探针引物Biotin-(Ac)15、Biotin-(AG)15、Biontin-(MAB)。2形成3个组合,用PCR方法对文库进行初步筛选;对可能的阳性克隆子进行测序复筛,选取微卫星侧翼序列足够长的序列设计引物,用荧光标记的基因分型技术以栽培柴胡种质为材料分析其多态性。结果:开发了5对多态性SSR标记,它们在5份柴胡栽培种质中共扩增出30.70个多态性等位基因,平均每条引物可以扩增出6.14个多态性等位基因;观察等位基因数最多13个,最少3个;有效等位基因数最多11.4个,最少1.6个。同时分析了4对EST-SSR引物,比较了2种SSR标记扩增结果。结论:磁珠富集法是开发柴胡多态性SSR标记的有效方法。
简介:目的:利用液相色谱串联质谱和非标定量技术,研究里氏木霉中磷酸化蛋白在不同培养条件下的表达差异,以期获得与纤维素酶表达调控相关的磷酸化蛋白。方法:分别在阻遏条件、诱导条件和中性条件下培养里氏木霉,提取胞内总蛋白,进行酶切和非标记定量分析。结果:对比诱导条件与阻遏条件、诱导条件与中性条件、阻遏条件与中性条件下培养的里氏木霉的胞内蛋白表达量差异,分别发现差异蛋白90、61和90个。根据其功能,可将这些差异蛋白归为四类,即锌指蛋白、ATP结合蛋白、具有N-乙酰化转移酶活性的蛋白以及具有氧化还原酶活性的蛋白。它们主要参与糖酵解、蛋白质合成、DNA修复以及转录调节过程。结论:发现的这些差异蛋白为研究调控纤维素酶的表达调控提供了新的线索。
简介:应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×105个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于107tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于1010tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly4Ser)315个氨基酸连接肽。