简介:作为一个模式植物,烟草在植物分子生物学研究中发挥着重要的作用。总RNA的提取质量,对于基因表达、基因克隆、cDNA文库建立、RNA原位杂交以及转基因材料鉴定等分子生物学基础研究至关重要。尤其在进行基因克隆及cDNA文库时,只有高质量的RNA,才能保证cDNA第一链合成的完整性。由于烟草中糖类、蛋白质及次生代谢物的含量较高,因此,在应用TRIzolRNA提取试剂盒进行烟草总RNA提取时,所提取的RNA产物中的蛋白质及多糖等杂质含量偏高。因此,针对这一问题,我们对TRIzol法进行了改进,并获得了高质量的烟草总RNA。经琼脂糖电泳检测,利用该方法提取的烟草总RNA,条带清晰、无拖尾现象,28S与18S的比例约为2:1。紫外吸收值的测定表明,所提取的烟草总RNA的A260/A280的值基本达到了1.9以上,说明所提取的RNA的质量较高,可广泛应用于基因的克隆及基因的表达研究。
简介:以卷丹、麝香百合品种富田和离体鲜切花的花蕾为材料,比较Trizol法、异硫氰酸胍法、CTAB改进法和SDS改进法提取总RNA的效果,结果表明,SDS改进法能有效去除多糖,提取的RNA中28SrRNA亮度约为18SrRNA的两倍,OD260/OD280值介于1.7-2.2之间,卷丹RNA得率为132.52μg/g,富田RNA得率为186.88μg/g。进一步用SDS改进法分别提取富田外轮花瓣、内轮花瓣、雄蕊、雌蕊、叶和茎的RNA,同样可以获得完整的纯度高的RNA,其中28SrRNA亮度约为18SrRNA的两倍,OD260/0D280值介于1.7~2.2之间,说明此方法适用于百合各个组织RNA的提取。经RT—PCR获得了花发育基因的特异性条带,说明用SDS改进法从百合中提取的RNA质量好、产率高、完整性强,完全适合于百合进一步的分子生物学研究。
简介:以橡胶树热研7-33-97花序为试验材料,分别采取3种蛋白质提取方法(TCA/丙酮法,酚抽提法和Tris-丙酮-酚法)提取橡胶树花序总蛋白。对3种蛋白质提取方法的蛋白提取率、单向SDS-PAGE电泳和双向电泳结果进行分析比较,结果表明3种方法中TCA/丙酮法的提取率最高(6.09±0.22)mg/g,单向SDS-PAGE电泳条带清晰且较完整,双向电泳后获得的蛋白点最多(994±25),是建立橡胶树花序蛋白质组学研究体系的较好方法。进一步对基于TCA/丙酮法提取的橡胶树花序总蛋白质双向电泳体系进行优化,结果显示利用pH范围为4~7的IPG胶条,在聚焦时间为7.0×10~4Vh、蛋白上样量为1.0×10~3μg,以及12.5%凝胶浓度条件下,考马斯亮蓝染色法获得的橡胶树花序蛋白质双向电泳图谱质量最好,可为橡胶树生殖发育相关蛋白质组学研究奠定良好基础。
简介:体细胞胚胎发生作为细胞全能性的一种表达方式,不仅是开展植物发育生物学理论研究的理想模型,而且在遗传改良和产业化快速繁殖等方面有着重大实践意义。虽然林木体细胞胚胎发生研究取得了很大的进展,但多数停留在形态发生方面的研究,并且进一步提高林木体细胞胚产量和质量变得越来越困难。随着分子生物学的迅速发展,将为体细胞胚产量和质量的提高提供保证。本文综述了林木体细胞胚胎发生的分子生物学方面的研究进展;主要从体细胞胚胎发生过程中的信号转导,如钙信号、激素信号、Nod因子和多肽激素信号分子,相关基因表达调控和蛋白质表达调控等方面进行了阐述。并结合上述重要问题探讨了林木体细胞胚胎发生过程中这些关键问题以及和应用前景。
简介:西红花总苷是栀子果实中的次生代谢产物,具有重要的药理作用,也是国际流行的天然色素"栀子黄"的主要成分。番茄红素β-环化酶b(lycopeneβ-cyclase,LCYb)催化合成了西红花总苷代谢途径的前体化合物-β-胡萝卜素。本研究利用RACE技术,从栀子果实中克隆了一条长1672bp的序列,含有一个1500bp的开放阅读框,编码499个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白具有番茄红素β-环化酶的结构域,分子量为56.39kD,N端有一个40个氨基酸组成的质体定位的信号肽,属于LCYb亚家族,因此命名为GjLCYb2。进行密码子优化后,利用两种原核表达系统诱导GjLCYb2融合蛋白表达,pSYNO-1系统可以在大肠杆菌中表达出可溶蛋白,pET-28a(+)系统表达的蛋白以包涵体形式存在。荧光绝对定量qPCR检测结果表明,在栀子果实发育成熟的过程中,GjLCYb2基因的表达量变化与西红花总苷的合成量变化趋势一致,表明GjLCYb2基因可以作为遗传操作的靶点,进行栀子果实中西红花总苷生物合成途径的调控。
简介:异源四倍体花生(ArachishypogaeaL.)包含两套基因组,分别来自二倍体祖先A.duranensis(A基因组)和A.ipaensis(B基因组)。相对于二倍体,异源四倍体SNP的鉴定和分析面临更多挑战,因为在SNP的鉴定和分析过程中,通常需要同时分析两套基因组中相同位点的DNA序列。本研究以12个花生品种和2个二倍体祖先为材料,通过扩增子重测序EST和GSS(各100条序列)开发SNP。结果显示共检测出18个EST-SNPs和44个genomic-SNPs,出现频率分别为1SNP/2557bp和1SNP/1011bp。为了进一步评估和应用所开发的SNP,采用高分辨率溶解曲线方法对96个花生品种进行SNP基因分型。EST-SNP在供试品种中的多态性信息量介于0.021~0.413,平均为0.172。Genomic-SNP的多态性信息量介于0.08~0.478,平均为0.249。本研究表明采用扩增子测序和HRM方法能够从异源四倍体花生中准确鉴定SNP,且所开发的SNP信息量丰富,能够用于花生遗传育种研究。