简介：鉴定合成的或通过高通量随机组合方法获得的潜在功能片段的生物学功能需要一套高效便捷的酵母表达专用载体。酵母表达载体pYES2多克隆位点处不含起始密码子,通过设计含有ATG和EcoRⅠ酶切位点的特异性引物扩增一段Intron,利用In-Fusion重组技术(Clontech)将该片段构建至酵母表达载体pYES2,得到一个含有ATG的重组酵母表达载体pYES2-ATG。为了检测该载体的功能,扩增不含起始密码子的DNA序列nlea,该序列由本实验室设计合成,具有潜在的耐盐功能。构建重组表达载体pYES2-ATG-nlea在酵母中进行功能鉴定。研究结果表明,半乳糖诱导后,含pYES2-ATG-nlea的重组酵母菌株耐盐能力明显高于含pYES2-ATG空质粒的菌株,表明在该载体系统上的添加了起始密码子的nlea成功表达,具有一定的耐盐性,同时也证明改造的载体系统可用于没有起始密码子的编码区序列的功能筛选和鉴定。pYES2-ATG酵母载体系统不影响原始载体基本功能元件的表达,同时能使不含起始密码子编码区序列在酵母中正常表达,在大规模进行多个基因的功能鉴定中具有重要的应用价值。

简介：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是（phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPC）是C4光合途径的关键酶之一。为了解籽粒苋PEPC基因密码子的使用特性，运用CHIP、CUSP、CodonW和SPSS软件分析籽粒苋PEPC基因密码子的偏好性，并分别与其他24种物种PEPC以及模式生物基因组进行比较。结果显示，籽粒苋PEPC基因偏好使用A～T结尾的密码子，26种偏好密码子（RSCU〉1）qh偏好性较强的有GCT、CTC和GTG（RSCU较强）。与其他物种同源基因相比，密码子选择偏性存在差异。进化树分析表明，基于雎PC基因编码序列聚类结果比密码子使用偏性分类结果能更准确地反映物种间的亲缘关系；密码子使用频率比较结果发现，酵母真核表达系统更适用于籽粒苋PEPC基因异源表达实验，而籽粒苋PEPC基因与模式植物基因组之间密码子使用偏性差异较小，尤其番茄可能为该基因转基因研究最为理想的受体。本研究为籽粒苋PEPC基因在作物高光效基因工程中选择最佳的外源表达系统以及提高其表达水平提供了前期的研究基础。

简介：为了解香蕉NBS抗病基因的密码子使用特点,掌握其基因编码规律,以香蕉全基因组NBS基因的74条高置信蛋白编码信息为数据来源,借助CodonW等软件对蛋白质的每个氨基酸编码数据进行了统计分析。结果表明,G＋C含量范围为32.8%~45.4%,共鉴定获得了GUC和UAC等8个最优密码子且全部以G或C结尾。中性绘图分析发现,大部分基因分布在对角线及其附近区域,ENC与GC3的关联分析显示大部分基因落在标准曲线附近,这些都表明密码子偏好性受到碱基突变影响较大。密码子各参数相关性分析表明,ENC和G3s、C3s的大小都呈显著负相关,在基因表达密码子使用时,更倾向于选择第三位碱基是G/C的同义密码子。本研究分析了香蕉全基因组NBS基因的密码子偏好性,为通过密码子优化来提高NBS基因在香蕉中的表达,对香蕉进行抗性改良具有十分重要的指导作用。

简介：启动子是调控外源基因在植物体内表达的“开关”。随着植物转基因技术的广泛应用，无论是基础研究还是应用研究，人们希望能够充分利用启动子来准确控制外源基因在植物体内的表达，使目的基因的“开”和“关”、表达的“多”和“少”、在“何地”和“何时”表达等。能够听从人的指挥，以实现植物育种的分子设计。因此，快速分离和鉴定植物体内各种特异启动子已经成为植物基因工程研究的热点和难点。本文在互补末端连接反向PCR（CELI—PCR）技术基础上建立起…种快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列的新方法。该方法利用CELI—PCR进行染色体连续步移，获取足够长的目的基因及其上游基因组DNA序列，再根据转录起始位点是目的基因转录本和启动子的分界点，其下游转录本中的外显于可通过RT-PCR扩增，而上游启动子序列则不能被RT-PCR扩增这一特点，借助RT-PCR进行cDNA连续步移，直到获得全长cDNA，确定启动子基因5’非翻译区的位置，进而精确定位转录起始位点。从而获取目的基因准确的启动子序列和全长cDNA序列。因此，建立在CELI，PCR基础上的RITIS技术，可绕过繁琐的构建cDNA库和5＇-RACE等方法快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列。