简介:摘要目的探讨组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)介导蛋白包涵体-自噬-溶酶体途径(AALP)在百草枯(PQ)诱导多巴胺能神经元自噬障碍中的作用。方法以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为多巴胺能神经元的体外模型,将细胞分为对照组和PQ染毒组(不同浓度PQ处理)。用不同浓度PQ (0、25、50、100、200和400 μmol/L)处理细胞24 h,100 μmol/L PQ处理细胞不同时间(0、12、24、36、48、60和72 h),CCK-8法检测细胞增殖活性;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞HDAC6、α-突触核蛋白(α-syn)、动力蛋白中链(Dynein IC1/2)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、自噬相关蛋白(Beclin1)、泛素结合蛋白(p62)和溶酶体相关膜蛋白-1(Lamp-1)的表达水平;免疫荧光双标法观察细胞HDAC6、α-syn、Dynein IC1/2、LC3、Lamp-1及γ-微管蛋白(γ-tubulin)在细胞中的表达及定位。结果PQ呈剂量和时间依赖性抑制SH-SY5Y细胞增殖活性(R=-0.950、-0.960,P<0.05);与对照组比较,PQ染毒组HDAC6、α-syn、p62蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而自噬标志蛋白(LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ)、Dynein IC1/2、Beclin1、Lamp-1表达水平降低(P<0.05);与对照组比较,PQ染毒组HDAC6与α-syn荧光信号增强,蛋白表达水平增高,而Dynein IC1/2、LC3、Lamp-1荧光信号减少,蛋白表达水平降低(P<0.05);PQ染毒诱导上述蛋白表达位置也发生变化,细胞质中的HDAC6由弥散状逐渐向细胞核聚集;α-syn、Dynein IC1/2、γ-tubulin、LC3、Lamp-1也逐渐由细胞质向细胞核聚集,并与HDAC6在细胞核共定位于核周区域。结论PQ可能通过诱导HDAC6介导蛋白包涵体-自噬-溶酶体途径障碍引起α-syn异常聚集。
简介:摘要目的初步探究自噬核心蛋白Atg101对白色脂肪细胞衰老的影响。方法构建Atg101敲减的3T3-L1成熟脂肪细胞模型,验证Atg101对自噬相关蛋白LC3和p62蛋白的影响。构建并分析人类皮下脂肪组织的RNA-seq数据库,基于Atg101与其他基因FPKM值的Pearson相关系数(R2>0.4, P<0.050)预测共表达基因集并进行KEGG和Reactome富集分析。构建年轻小鼠(8周龄)和老龄小鼠(18个月龄)模型,实时定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测Atg101在腹股沟皮下脂肪和内脏脂肪中的表达水平。进一步通过RNA-seq、Western印迹和RT-qPCR检测白色脂肪细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)、细胞周期及线粒体稳态相关基因的表达差异,分析Atg101敲减对脂肪细胞衰老的影响。结果在3T3-L1脂肪细胞敲减Atg101后自噬相关蛋白LC3-Ⅱ显著降低,p62蛋白明显上调,提示细胞自噬受损。KEGG富集分析发现Atg101共表达基因集主要富集于自噬和衰老相关通路;Reactome富集分析发现该基因集与多个细胞周期信号通路相关。RT-qPCR和Western印迹证实Atg101在老龄小鼠皮下脂肪组织中mRNA和蛋白表达水平均下调,内脏脂肪组织蛋白水平也显著降低。最后,白色脂肪细胞模型中Atg101敲减后SASP相关基因表达上调,细胞周期特异性基因表达受限并且细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子p16、p21表达显著增高,线粒体稳态调节基因表达也受到抑制。结论Atg101可能通过影响自噬活动调控白色脂肪细胞衰老,从而破坏线粒体稳态。
简介:摘要目的探讨骆驼蓬总碱(TAH)能否诱导神经细胞自噬并促进神经毒性蛋白Tau蛋白和α-突触核蛋白(α-Syn)的降解。方法(1)将体外培养的PC12细胞分为空白对照组及1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH组,分别加入0、1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH作用24 h,观察细胞形态及数目的变化,采用MTT法检测细胞存活率;(2)将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH组,分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬激活剂雷帕霉素及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH作用4 h,采用免疫荧光染色检测细胞自噬体数;(3)将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组、10 μg/mL TAH组,分别加入等量溶剂、50 nmol/L雷帕霉素、10 μg/mL TAH作用4 h,Western blotting检测细胞p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白的表达;(4)将PC12细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组,分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬抑制剂氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用4 h,Western blotting检测细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达;(5)将PC12细胞分为TAH组和空白对照组,分别加入10 μg/mL TAH和等量溶剂处理4 h后,Western blotting检测细胞磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶(p-p70S6K)的表达;(6)将过表达Tau-绿色荧光蛋白(GFP)的Tet on HEK293细胞分为空白对照组、TAH组、强力霉素组、强力霉素+TAH组、强力霉素+TAH+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、强力霉素+TAH+氯喹组,后4组细胞加入200 ng/mL强力霉素处理24 h后,空白对照组加入等量溶剂,TAH组加入10 μg/mL TAH,后3组细胞分别加入10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+5 mmol/L 3-MA、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹,作用24 h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞绿色荧光强度的变化,Western blotting检测细胞Tau-GFP和LC3-Ⅱ蛋白的表达;(7)将稳定表达α-Syn的HEK293细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组,分别加入等量溶剂、50 nmol/L氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用24 h,Western blotting检测细胞α-Syn和LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果(1)与空白对照组比较,20、50 μg/mL TAH组细胞存活率降低,且50 μg/mL TAH组细胞存活率低于20 μg/mL TAH组,差异均有统计学意义(P<0.05);(2)与空白对照组比较,雷帕霉素组、10、20 μg/mL TAH组细胞自噬体数增多,且10 μg/mL TAH组细胞自噬体数多于20 μg/mL TAH组,差异均有统计学意义(P<0.05),因此,选择10 μg/mL TAH用于后续实验;(3)与空白对照组比较,雷帕霉素组、TAH组细胞p62蛋白的表达均降低,LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加,差异均有统计学意义(P<0.05);(4)与空白对照组比较,氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加,且TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组,差异均有统计学意义(P<0.05);(5)与空白对照组比较,TAH组细胞p-mTOR、p-p70S6K的表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);(6)强力霉素组细胞Tau-GFP蛋白的表达较空白对照组增加,强力霉素+TAH组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素组降低,强力霉素+TAH+3-MA组、强力霉素+TAH+氯喹组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较空白对照组增加,强力霉素+TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素组增加,强力霉素+TAH+3-MA组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组降低,强力霉素+TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高,差异均有统计学意义(P<0.05);(7)与空白对照组比较,TAH组HEK293细胞α-Syn蛋白的表达降低,LC3-Ⅱ蛋白的表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05);TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组,TAH+氯喹组细胞α-Syn蛋白的表达高于TAH组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论TAH可能通过抑制mTOR/p70S6K信号通路激活神经细胞自噬,从而促进Tau和α-Syn的降解。
简介:自噬是溶酶体降解途径之一,细胞利用自噬维持着胞内大分子和细胞器的循环利用。自噬的功能主要是在营养缺乏状态下维持着细胞代谢的平衡以及在环境压力下清除损伤的细胞器以利于细胞的存活。如今,自噬又显示出其抑制肿瘤的作用。自噬的缺失经常伴随着肿瘤的发生,比如在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中出现自噬调节基因beclin1的缺失,而beclin1基因敲除的小鼠更表现出癌变倾向。自噬是怎样抑制肿瘤发生的是当前生命科学界最感兴趣的课题之一,到目前为止,人们已发现细胞自发机制(涉及染色体完整性和稳定性的保护)和非细胞自发机制(涉及坏死和炎症的抑制)参与其中。在治疗过程中,自噬的作用也非常复杂,一方面,由于肿瘤细胞能够依赖自噬功能来缓解由药物和射线诱导的压力而利于自身存活,所以,在化疗和放疗的同时应用自噬的抑制剂被视为当今癌症治疗的一个新手段,另一方面,诱导自噬可以维持细胞内蛋白质和细胞器的更新、抑制DNA的损伤和染色体的突变并且能限制由坏死引起的炎症而实现细胞的适应性,因而,诱导自噬可能在癌症的预防中扮演着重要的角色。
简介:摘要目的探讨脂多糖(LPS)刺激下NUFIP-1介导核糖体自噬在树突细胞(DCs)凋亡中的作用及意义。方法将培养的树突细胞系DC2.4分为空白对照组及LPS刺激6、12、24、48、72 h组(n=5),LPS各亚组加入1 μg/mL LPS培养相应时间。采用Western blot检测各组细胞NUFIP-1及自噬相关蛋白p62和LC3B表达水平,激光共聚焦显微镜检测NUFIP-1在细胞中的表达与定位及其分别与Lyso-tracker、LC3B共定位情况。将载有沉默空载体NS及沉默慢病毒载体NUFIP-1 siRNA感染DC2.4 (n=3),以1 μg/mL LPS刺激24 h,应用流式细胞分析术检测细胞凋亡情况,并采用Western blot检测凋亡相关蛋白包括胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)和Bcl-2表达水平。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD-t法进一步进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果Western blot结果提示,LPS刺激不同时间(6、12、24、48、72 h)后DC2.4中NUFIP-1蛋白表达水平呈现先升高后下降趋势,其中LPS 24 h组NUFIP-1表达水平显著高于空白对照组[空白对照组:(0.6786 ± 0.0820);LPS 24 h组:(1.4830 ± 0.1170),P<0.01]。同时,LPS 24 h组p62表达水平显著低于空白对照组[空白对照组:(0.9087 ± 0.1235);LPS 24 h组:(0.3113 ± 0.5571),P<0.01]。LPS 24 h组LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转化显著高于空白对照组[空白对照组:(0.5542 ± 0.1248);LPS 24 h组:(2.5310 ± 0.3119),P<0.01]。激光共聚焦显微镜观察显示,NUFIP-1主要定位于细胞核及核周,LPS刺激后其荧光强度于6 h至24 h呈时间依赖性增强,而刺激48、72 h明显减弱。同时,NUFIP-1与Lyso-tracker及LC3B的共定位较空白对照组显著增强。采用慢病毒感染技术感染NUFIP-1 siRNA可显著下调DC2.4 NUFIP-1表达水平,与空白对照组及空载体组比较分析,差异有统计学意义[空白对照组:(0.6627 ± 0.1707);空载体组:(0.6966 ± 0.1107);siRNA组:(0.1428 ± 0.0296),P<0.05]。流式细胞分析术显示,NUFIP-1 siRNA感染组在LPS刺激后较空白对照LPS 24 h组及空载体LPS 24 h组DC2.4凋亡率显著升高[空白对照LPS 24 h组:(47.91%±1.006%);空载体LPS 24 h组:(70.26% ± 1.011%);siRNA LPS 24 h组:(80.23% ± 2.094%),P<0.01]。Western blot分析进一步证实,NUFIP-1 siRNA感染组相较空白对照组及空载体组在LPS刺激下DC2.4凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达显著增强[空白对照LPS 24 h组:(0.4748 ± 0.0876);空载体LPS 24 h组:(0.2849 ± 0.0418);siRNA LPS 24 h组:(0.9733 ± 0.0525),P<0.01],抗凋亡蛋白Bcl-2表达则明显下调[空白对照LPS 24 h组:(0.7810 ± 0.0490);空载体LPS 24 h组:(0.8292 ± 0.0729);siRNA LPS 24 h组:(0.3957 ± 0.0838),P<0.05]。结论LPS刺激后DC2.4中NUFIP-1介导核糖体自噬明显活化,且对DC2.4凋亡具有显著保护效应。
简介:2016年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给了大隅良典。他是谁呢?大隅良典是日本东京大学的理学博士,他可是一个在行业里鼎鼎大名的人。诺贝尔奖颁发给他是由于他发现了细胞自噬的机制。细胞大家都知道,那自噬又是什么?让我们一一道来。
简介:散发性包涵体肌炎(sporadicinclusionbodymyositis,sIBM)为一组老年慢性、进行性骨骼肌炎性疾病。1971年由Yunis等首先提出,1978年Carpenter等正式确立该病为一独立疾病实体。临床主要表现为进行性四肢无力,以屈指、屈腕及伸膝力弱最为显著。病理改变以骨骼肌出现炎性细胞浸润、肌纤维内镶边空泡(RV)和淀粉样物质沉积,以及电子显微镜下观察到管丝样包涵体为特点。对糖皮质激素治疗不敏感是该病的特点之一,目前尚缺乏有效的治疗手段。虽然国外文献报道散发性包涵体肌炎为老年人最常见的进行性骨骼肌疾病,但目前国内对这一疾病还缺乏足够的认识。现仅结合文献及临床体会对该病的发病机制、临床表现、病理改变及诊断与治疗进行综述。
简介:摘要目的分析毒死蜱对大鼠海马神经元自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在急性毒死蜱中毒中枢神经损伤中的作用。方法于2018年10月,将35只雄性清洁级SD大鼠根据观察时间点随机分成7组,即0.5 d、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d组和对照组,每组5只。各观察组采用81.5 mg/kg毒死蜱一次性灌胃处理,对照组给予橄榄油灌胃。连续观察大鼠一般情况和中毒症状,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测海马组织中自噬相关蛋白Beclin1、P62/SQSTM1、LC3的表达,免疫组织化学染色观察脑组织细胞形态和LC3表达。结果Western blot结果显示,与对照组比较,1 d、2 d、3 d组大鼠海马神经元Beclin1蛋白表达升高,0.5 d、1 d、2 d组P62/SQSTM1蛋白表达降低,2 d组大鼠海马神经元LC3蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,5 d组大鼠海马神经元排列紊乱,部分细胞核轮廓消失,7 d组尤其明显,LC3蛋白呈胞质表达,表达量逐渐增高,第2天达高峰。结论急性毒死蜱中毒大鼠自噬的早期激活可能参与了毒死蜱诱导的海马神经元损伤。