迷迭香水溶性成分清除·OH自由基活性研究

【摘要】 　　目的研究迷迭香水溶性成分清除·OH自由基的活性。方法采用电子顺磁共振技术（EPR）和自旋捕集技术，研究迷迭香不同浓度水溶性成分清除·OH自由基的活性。结果迷迭香水溶性成分具有较高的清除·OH自由基性能，样品浓度为2.5 mg/ml时，自由基清除率可达73.5%。结论EPR技术测定迷迭香水溶性成分清除·OH自由基性能直接快速，迷迭香水溶性成分具有良好的清除自由基活性。

【关键词】 电子顺磁共振技术； 迷迭香； ·OH自由基

　　Abstract:ObjectiveTo study the Scavenging capacity on Hydroxyl free radical of the water-solubility components from Rosmarinus officinalis L. MethodsThe scaverging capacity on Hydroxyl free radical of different concentration water-solubility components from Rosmarinus officinalis L. was studied by EPR and spin catch technology.ResultsWater-solubility components from Rosmarinus officinalis L. had good capacity of scavenging ·OH free radical, the radical clearance rate achieved 73.5% when the sample concentration was 2.5 mg/ml. ConclusionThe determination method of scavenging radical by EPR technology was direct and quick. Water-solubility components from Rosmarinus officinalis L. has good capability of scauenging hydroxyl radical.

　　Key words: EPR; Rosmarinus officinalis L.; ·OH free radical

迷迭香Rosmarinus officinalis L.，系唇形科迷迭香属植物，原产地中海地区。1981年由中国科学院植物研究所北京植物园引入我国［1］。目前，我国南方已广为栽种。迷迭香含有大量的抗氧化成分，具有很强的抗氧化性，是一种优良的天然抗氧化剂［2］。对于迷迭香成分的研究，国外有大量的报道和专利，其主要成分为二萜酚类、黄酮类、三萜类和精油等［3］。自由基是带有未成对电子的分子或离子，具有很高的反应活性。它可对机体产生毒害，破坏生物大分子，影响细胞活性，主要损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及亚微结构，并引起一系列有害的生化反应。抗氧化剂可用于许多与氧自由基氧化伤害有关的疾病的防治，其在医药中的应用研究已经形成了一个自由基医药学新学科。迷迭香天然抗氧化剂在药品、化妆品和食品等多方面已有应用［4］，且我国很多地区已大面积种植，所以深入研究迷迭香提取成分的抗氧化活性及其抗氧化机理对于迷迭香的综合开发利用具有重要意义。

　　电子顺磁共振技术（EPR）主要用于研究具有未成对电子结构的自由基、原子、分子，灵敏度比核磁共振（NMR）高230倍［5］，是检测自由基最直接有效的方法［6］。·OH自由基是已知最强的氧化剂，对机体危害极大。本研究采用Fenton反应体系产生·OH自由基，利用EPR技术和自旋捕集技术研究迷迭香水溶性成分清除·OH自由基的能力。

　　1 试剂及仪器

　　1.1 试剂迷迭香样品购自福建，DMPO(5,5-DIMETHYL-1-PYRROLINE N-OXIDE)购自美Sigma公司，使用前进行处理，使之无顺磁信号，其它试剂均为分析纯。

　　1.2 仪器电子顺磁共振波谱仪BRUKER A320（德国BRUKER），超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司），微量进样器（德国Eppendorf），pH测定仪（Sartorius），电子天平（Sartorius）。

　　2 方法

　　2.1 样品处理称取100 g迷迭香干叶，10倍量水加热回流提取，过滤，将滤液干燥得浸膏。

　　2.2 样品液配制称取1g浸膏，超声波定容，配成10 mg/ml的溶液，并进行稀释，依次得到5.0，2.5，1.0，0.5 mg/ml的样品液。

　　2.3 ·OH自由基产生体系0.05 mol/L PBS（pH=7.4）溶液，1.0 mmol/L FeSO4(NH4)2SO4，0.9 mol/L DMPO，6%H2O2。将以上4种溶液和样品液或去离子水（空白对照）各10 μl注入Eppendorf管，记录反应时间，并立即混合均匀，将反应液打入石英毛细管，外加保护管放入谐振腔进行测定。

　　2.4 EPR测试参数中心磁场（CF）：3 480 G，扫描宽度（SW）：500 G，扫描时间（ST）：5.12s：，调制幅度（MA）：1G，调制频率（MF）：100 kHz，微波功率（MP）：20 mW，测试温度（T）：室温。3 结果

清除率E=(h0-hi)/h0。hi为含样品体系中·OH自由基的信号强度测量值；h0为空白体系中·OH自由基的信号强度测量值。空白体系EPR谱图见图1，样品EPR谱图见图2。

各浓度样品的·OH自由基清除率见表1。 表1 不同浓度样品的·OH自由基清除率（略）

　　4 讨论

EPR波谱技术可以直接从体外研究抗氧化物质对·OH自由基的清除作用，是自由基研究最直接最有效的技术，且灵敏度高。因自由基寿命很短，含量低，所以采用自旋捕集技术，生成寿命较长的自由基产物，以便EPR波谱仪的检测。本研究利用Fenton反应体系产生·OH自由基，以DMPO作为自旋捕集剂，研究了迷迭香水溶性成分清除·OH自由基的活性，效果较好，在样品浓度为2.5 mg/ml时，自由基清除率可达73.5%。

　　通过数据可以看出，迷迭香水溶性成分具有良好的清除·OH自由基的活性。对不同浓度样液的EPR谱图分析表明，样液与·OH自由基存在复杂的浓度依赖关系。随着样品浓度的变化，反应体系中与·OH自由基作用的各成分主从地位可能发生变化，且各种成分可能具有协同效应或相互抑制作用，从而使总反应体系的清除·OH自由基能力发生变化，因此，在中药应用过程中，应重视各成分的协同效应和抑制作用，而不是片面的追求单一成分。如何尽可能地使有效成分的利用达到较高的水平，有待于进一步研究。

【参考文献】
　　［1］王文中,王颖.迷迭香的研究及其应用——抗氧化剂［J］.中国食品添加剂,2002,(5):60.

　　［2］刘先章,赵振东,毕良武,等.天然迷迭香抗氧化剂的研究进展［J］.林产化学与工业,2004,24（增刊）：132.

　　［3］屠鹏飞,徐占辉,郑家通,等.新型资源植物迷迭香的化学成分及应用［J］.天然产物研究与开发,1998,10(3):62.

　　［4］张婧,熊正英.天然抗氧化剂迷迭香的研究进展及其应用前景［J］.现代食品科技,2005,21(1):135.

　　［5］郭亚力,李聪,欧灵澄,等.槐米中天然抗氧化剂的提取及其抗自由基性能研究［J］.食品科学,2004,25（7）:154.

　　［6］赵保路.氧自由基和天然抗氧化剂(修订版)［M］.北京:科学出版社,1999:24.