实时荧光定量 PCR检测 lncRNA干扰效果

实时荧光定量 PCR检测 lncRNA干扰效果

刘海柏 12 ，王丹琪， 刘慧 1（通讯作者）

1 长沙医学院 湖南 长沙 410000 2 石家庄医学高等专科学校 050000

[摘要] 目的：探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)干扰后，在人支气管上皮细胞（the human bronchial epithelial cells，16HBE）中的表达情况。方法:应用real-timePCR方法检验lncRNA- ENST00000414355干扰效果。结果: 正常16HBE细胞中ENST00000414355干扰48h后，三条阳性序列的实验组ENST00000414355表达均下降，都具有统计学意义P值均<0.0001；在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中ENST00000414355干扰后，第一条阳性序列转染下达到沉默效果，且具有统计学意义P<0.0001；在氯化镉转化16HBE第35代细胞在ENST00000414355三条阳性序列转染下没有出现沉默效果所示。结论：ENST00000414355在正常16HBE细胞中干扰效果最明显，在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中只有一条序列有干扰效果。

[关键词] 实时荧光定量PCR，LncRNA，16HBE

镉(Cadmium，Cd)是一种毒性极强的重金属元素，在自然界中广泛存在^[1]。镉具有广泛的毒理学效应，镉及其化合物可通过呼吸道和消化道进入机体，从而对机体产生毒性损害，长期摄入低剂量的镉会引起机体慢性中毒，对肾脏、骨骼、生殖、呼吸及免疫系统都有毒副作用，甚至导致多种癌症的发生。近年来的研究表明，lncRNA以RNA的形式调控蛋白编码基因在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面的表达水平^[1] 。并且，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记现象以及染色质修饰、转录激活、转录干扰，及转录后调控、核内运输、调节原癌基因活化等多种重要的调控过程^[2-3]，本次课题旨在研究LncRNA在镉恶性转化16HBE细胞中的沉默表达。

1.材料和方法

1.1试验材料

1.1.1细胞 正常人支气管上皮细胞（the human bronchial epithelial cells，16HBE）, 氯化镉（CdCl₂）诱发16HBE细胞恶性转化至第5代细胞、氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化至第15代细胞、氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化至第35代细胞、氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化成瘤细胞^[1]均用含胎牛血清10%( V/ V) 的MEM培养液, 在37℃、5% CO₂、饱和湿度环境中培养。

1.1.2试剂、仪器 MEM培养基（Hyclone,USA）、胎牛血清（Hyclone,USA）、反转录试剂盒(Fermentas K1622) (Fermentas，canada）、RT-PCR试剂盒Fermentas k0222 (Fermentas，canada） 、超净工作台（MOV-13BSU,SANYO,Japan）

高压蒸汽灭菌器（MLS-3750，Sanyo，Japan）、高速低温离心机（AllegraTM X22R,Beckman，USA）、低速离心机（Model-LSY，Beijing，China）、微型离心机（MSE, Sanyo，Japan）、PCR仪器（ABI Stepone Plus，USA）

1.2试验方法

1.2.1 siRNA干扰

为了达到干扰效果，lncRNA-ENST00000414355[2]设计三个阳性干扰序列使lncRNA在正常16HBE细胞、氯化镉转化16HBE第35代细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞中沉默掉。实验分3组：目的质粒转染组、对照siRNA干扰转染组和未转染组。lncRNA- ENST00000414355干扰设计的三组阳性序列为实验组，siRNA-NC为对照组：

表1 lncRNA-ENST00000414355 siRNA干扰引物的核苷酸序列

1.2.2 细胞转染

1）转染前一天，培养基换成不含抗生素的培养基；

2）转染当天，细胞汇合率达到70%以上;

3）吸去旧的培养基，用PBS轻洗2次，每孔加入1.6ml 无血清培养基，置于5% CO₂、37℃培养箱中；

4）取浓度为20μM的siRNA/microRNA 2μl, 加入400μL无血清培养基中，混匀后，加入4μL Turbofect siRNA transfection reagent，混匀后在室温下孵育15-20min。

5）每孔加入上述(4)中孵育好的转染复合液400μl，置于5% CO₂、37℃培养箱中培养4-6h后换成正常的完全培养基。

6) 转染后48h，检测RNA表达水平。

1.2.3 Real-time PCR反应

ABI Stepone Plus仪器上进行lncRNA-ENST00000414355在正常16HBE细胞，镉处理16HBE细胞35代龄和恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞中的定量PCR，用于确定siRNA干扰沉默效果。引物为ENST00000414355之前设计好的引物。

1.3结果与分析

正常16HBE细胞中ENST00000414355干扰48h后，三条阳性序列的实验组ENST00000414355表达均下降，都具有统计学意义P值均<0.0001(如图1)；在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中ENST00000414355干扰后，第一条阳性序列转染下达到沉默效果，且具有统计学意义P<0.0001(如图2)；在氯化镉转化16HBE第35代细胞在ENST00000414355三条阳性序列转染下没有出现沉默效果(如图3)所示。

图1 siRNA- ENST00000414355干扰48h后在正常16HBE细胞中的表达水平

图2 siRNA- ENST00000414355干扰48h后在镉转化成瘤细胞中的表达水平

图3 siRNA- ENST00000414355干扰48h后在镉转化35代细胞中的表达水平

1.4讨论

随着LncRNA不断被发现，研究人员越来越关注LncRNA在各种生物学过程以及疾病中的功能。为了更好地研究LncRNA的功能，在差异高标达的LncRNA中选取了在16HBE细胞中及转化细胞中表达趋势最明显且表达水平具有统计学意义的LncRNA-ENST00000414355进行进一步研究，将LncRNA-ENST00000414355在16HBE细胞沉默，通过Real-time PCR验证沉默效果验证，其结果差异有统计学意义。

[参考文献]

[1] Miao Sun, W. Lee Kraus. From Discovery to Function: The Expanding Roles of Long NonCoding RNAs in Physiology and Disease[J]．Endocr Rev,2015 , 36(1): 25–64.

[2] Francesco P. Marchese, Ivan Raimondi, Maite Huarte.The multidimensional mechanisms of long noncoding RNA function [J].Genome Biol,2017; 18: 206.

[3] Jeremy Ew．Hongjae S．David LS．Long non coding RNAs：functional surprises from the RNA world [J].Genes Dev，2009，23(13)：1494-1504．

作者简介：刘海柏（1986年5月-），女，长沙，硕士研究生，讲师，主要研究方向：劳动卫生与环境卫生学，E-mail：461430784@qq.com

通讯作者：刘慧（1984年10月-），讲师， 研究方向：营养与食品毒理学

项目编号：湖南省教育厅科学研究项目，镉恶化转化16HBE细胞中LncRNA对DNA修复基因的调控作用（15C0140）