生物样品中尼古丁及其代谢产物的GC-MSD法测定

生物样品中尼古丁及其代谢产物的GC-MSD法测定

孙晓红于波包金洋刘彤罗侃

孙晓红于波包金洋刘彤罗侃（哈尔滨市疾病预防控制中心黑龙江哈尔滨150056）

【摘要】目的建立对生物材料中尼古丁及其代谢产物的分析方法。方法建立的尼古丁及其代谢产物的气相色谱质谱联用的检测技术和方法，为烟草暴露评价提供了客观可靠的方法。结果尼古丁和可替宁的检出限为分别为0.06μg/mL、0.14μg/mL，测定下限分别为0.020μg/mL、0.048μg/mL。RSD尿液中尼古丁和可替宁分别为2.02%-2.62%、5.27%-7.24%；头发中尼古丁和可替宁分别为1.09%-2.89%、2.71%-6.61%。尿液中尼古丁及可替宁的加标回收率分别为82.01%-105.90%、82.20%-99.78%；头发中尼古丁的加标回收率分别85.33%-103.91%。结论由于采用了毛细管气相色谱分离技术和选择离子扫描采集数据，可有效排除其他组分对尼古丁的干扰。

【关键词】生物样品GC-MSD尼古丁及其代谢产物

吸烟和被动吸烟是肺癌、慢性呼吸系统疾病、冠心病、脑卒中等多种疾病发生和死亡的重要危险因素。在世界前8位死因中，吸烟是其中六种疾病的危险因素。近几年，我国人群二手烟暴露状况没有任何改善。保护非吸烟者免受二手烟的危害已迫在眉睫。尼古丁是烟草中存在的一种生物碱,可以作为烟草暴露的特异性污染物,尼古丁半衰期较短，其代谢物可替宁因半衰期长而作为检测吸烟和戒烟的标志物。尼古丁及其代谢物的实验室样品分析方法使用气相色谱质谱联用技术。

1材料与方法

1.1试剂和材料

1.1.1三氯甲烷：色谱纯；

1.1.2尼古丁：色谱纯；

1.1.3可替宁：色谱纯；

1.1.4喹啉：色谱纯；

1.1.5甲醇：分析纯；

1.1.6NaOH溶液：c（NaOH）=1.5mol/L，取60.0g的NaOH溶于1L纯水中，混匀；

1.1.7氦气：99.999%或以上纯度。

1.2样品采集

尿液：收集烟草暴露2-3小时的受试者尿液（约30ml）于已编号的50ml聚丙烯塑料瓶中，加入硫酸氢钠0.5g—1.0g（以防止尿样腐败，同时保证尿样中尼古丁和可替宁在运输和贮存过程中稳定），拧紧瓶盖，于4℃冰箱中冷藏可保存一周，零下20℃可保存一个月。

头发：取受试者枕后离头皮2cm处的头发（约1g）收集在已编号的纸质信封中，常温保存。

1.3分析步骤

1.3.1标准溶液

准确称取100.0mg尼古丁、可替宁溶于10mL异丙醇溶液中，配成每毫升含10mg的尼古丁、可替宁标准混合储备液；称取约400mg喹啉溶于10mLC7溶液中，配成每毫升含40mg喹啉的内标一级溶液；分别移取0，0.1，0.2，0.4，0.6，1.0mL混合储备液于6个10mL容量瓶中，再各加入0.1mL内标一级溶液，用C7稀释到10.0mL，配成浓度分别是0.1，0.2，0.4，0.6，1.0μg/μL，含内标约0.4μg/μL的标准系列。另取0.1mL40mg/mL的内标一级溶液，用C7稀释到10mL，配成含内标0.4μg/μL的内标二级溶液，用于向样品中加入内标。

1.3.2样品处理

头发：取约500mg的头发依次用纯水、二氯甲烷洗涤，去除外源性物质的干扰，自然晾干后剪至1-2mm，准确称取100mg的头发加入3ml1.5MNaOH溶液，超声30分钟后水浴37度消解3小时。取消解完全的头发2ml，加入1ml含有内标物喹啉的三氯甲烷，在涡旋混合器上充分混合75秒（先混合40秒，再混合35秒），将混合液离心5min(7000rpm)，静置待分层后弃去上层水相，下层有机相待测。

尿液：将保存于4℃冰箱中的尿液在室温下放置30min，取2ml的尿液于试管中，加入100μl2MNaOH溶液，1ml含有内标物喹啉的三氯甲烷，在涡旋混合器上充分混合75秒（先混合40秒，再混合35秒），将混合液离心5min(7000rpm)，静置分层后弃去上层水相，下层有机相待测。

1.3.3仪器分析条件

进样口温度：250℃；载气流量：1mL/min；分流比：20:1；

柱子程序升温：初始温度140℃保持1min,5℃/min升到160℃保持1min,再以30℃/min升到230℃保持1min;再以75℃/min升到280℃保持2min。

离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；接口温度：280℃；溶剂延迟：3min；

SIM采集数据，尼古丁特征离子分别为m/z：162，133，84，42，其中84为定量离子；可替宁特征离子分别为m/z：98，119，147，176其中98为定量离子；二苯胺特征离子分别为m/z：51，66，77，169其中169为定量离子。

2结果与讨论

2.1实验条件的选择

2.1.1色谱柱的选择为了减少柱流失而选择MS柱，因此选择DB-5MS毛细管色谱柱（0.25mm×30m×0.25m）。

2.1.2气相色谱条件的选择在保障各组分的充分分离，又得到比较理想的色谱峰型，并使实验时间尽量缩短，选择炉温：140℃（1min）→（30℃/min）→230℃(1min)→(75℃/min)→280℃(2min)进样口：250℃，分流比：20:1，载气流量：1ml/min，溶剂延迟：3min；。

2.2标准工作曲线及检出限

在选定的色谱工作条件下进样，以尼古丁、可替宁标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程见表1。

3小结

由于采用了毛细管气相色谱分离技术和选择离子扫描采集数据，可有效排除其他组分对尼古丁的干扰。

尼古丁和可替宁的检出限为分别为0.06μg/mL、0.14μg/mL，测定下限分别为0.20μg/mL、0.48μg/mL。RSD尿液中尼古丁和可替宁分别为2.02%-2.62%、5.27%-7.24%；头发中尼古丁和可替宁分别为1.09%-2.89%、2.71%-6.61%。尿液中尼古丁及可替宁的加标回收率分别为82.01%-105.90%、82.20%-99.78%；头发中尼古丁的加标回收率分别85.33%-103.91%。

参考文献

[1]何怡,徐东群.尿液和头发及唾液中尼古丁及其代谢物可替宁的气相色谱-质谱同时测定法[J];环境与健康杂志;2011年02期.

[2]谷素英,黎源倩,刘驰青,杨小琪,李磊,马少俊.杨功焕.毛细管气相色谱法测定头发中尼古丁及其代谢产物可的宁[J];四川大学学报(医学版);2008年01期.