HPLC法同时测定蛇油膏中羟苯甲酯及羟苯乙酯的含量

HPLC法同时测定蛇油膏中羟苯甲酯及羟苯乙酯的含量

陈文杜明月刘浩然

（1惠州卫生职业技术学院广东惠州516025）

（2湖南大学化学化工学院湖南长沙410082）

【摘要】目的：建立同时测定蛇油膏中羟苯甲酯和羟苯乙酯含量的方法。方法：蛇油膏前处理采用甲醇加热及冰浴去除杂质。色谱条件为：KromasilC18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为：甲醇：0.1%醋酸(v/v)＝47:53。流速为1mL·min-1；柱温为32℃；检测波长为256nm。结果：羟苯甲酯及羟苯乙酯分别在3.28～32.8μg/mL，3.64～36.4μg/mL范围内呈良好线性关系，其平均回收率分别为98.56±1.32%及98.92±1.24%。结论：该法重现性好，回收率高，适合于蛇油膏中羟苯甲酯及羟苯乙酯的质量控制。

【关键词】HPLC；蛇油膏；羟苯甲酯；羟苯乙酯

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）19-0352-02

隆力奇蛇油膏是常用的护手霜，其成份复杂。除了主要活性成份蛇油外，还有众多基质成份及附加剂。其中，防腐剂为羟苯甲酯和羟苯乙酯。为对其进行质量控制，有必要建立其测定方法。根据其基质的特点，本研究前处理采用了超声波破乳、冰浴及离心等方法，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了羟苯甲酯、羟苯乙酯的含量。方法相对简便、精密度好，回收率较高。报道如下。

1.材料

1.1药品与试剂

羟苯甲酯（对照品，中国食品药品检定研究院，批号：100278-201404）；羟苯乙酯（对照品，中国食品药品检定研究院，批号：100847-201203）；超纯水为自制品；甲醇（色谱纯，美国Tedia试剂公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

岛津高效液相色谱系统：SPD紫外检测器，LC-20AT二元高压输液泵；昆山超声仪器有限公司生产的KQ-3200E型超声波清洗器。海门其林贝尔仪器公司生产的Vortex-6旋涡混合仪。瑞士梅特勒－托利多公司生产的AL204型精密电子天平。

2.方法与结果

2.1供试品溶液的制备

精密称取隆力奇蛇油膏1.000g置于锥形瓶中，加入甲醇50mL，采用保鲜膜封口，放置于水浴（85℃）中[1]，融化后立即在旋涡混合器上振荡混合2min，滴加氨水一滴，放置于冰浴冷却1.5h，过滤。锥形瓶和滤器用40mL甲醇分三次洗涤，于100mL容量瓶中滤液收集，甲醇定容。以0.22μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液，备用。

2.2色谱条件

色谱柱：瑞典AkzoNobel公司生产的KromasilC18柱（150mm×4.6mm，5μm）。检测波长：256nm；流动相：甲醇：0.1%醋酸＝47:53。流速：1.0mL/min。柱温：32℃。进样量：20μL。

2.3专属性实验

由于未获知蛇油膏具体配方，故无法制备空白基质。我们采取在原蛇油膏的基础上分加入羟苯甲酯、羟苯乙酯的方法来测定方法专属性。按2.1项下方法处理，按2.2项下的色谱条件测定。另取羟苯甲酯及羟苯乙酯对照品在上述色谱条件下测定。蛇油膏样品图、羟苯甲酯对照品色谱图及羟苯乙酯对照品色谱图如图1所示，在与对照品相同保留时间处，基质成份在对照品保留时间内无干扰，供试品溶液出现相应的色谱峰。

图1蛇油膏样品（A）、羟苯甲酯（B）及羟苯乙酯（C）色谱图

1:羟苯甲酯，tR:6.75min；

2:羟苯乙酯，tR:12.58min.

2.4线性关系考察

精密称取羟苯甲酯16.4mg、羟苯乙酯18.2mg，分别加入50ml容量瓶中配制成对照品母液。再分别取适当体积以色谱甲醇配制成羟苯甲酯浓度分别为32.8μg/mL、22.96μg/mL、13.12μg/mL、6.56μg/mL、3.28μg/mL，羟苯乙酯浓度分别为36.4μg/mL、25.48μg/mL、14.56μg/mL、7.28μg/mL、3.64μg/mL的系列对照品混合溶液。取以上对照品混合溶液，按2.2项下的色谱条件进样，每次进样20μL，记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。羟苯甲酯浓度与峰面积的线性关系为：A=33098.2c+3892.3，r=0.9998；羟苯乙酯浓度与峰面积的线性关系为：A=32891.6c+4322.5，r=0.9996。

2.5精密度试验

取对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次进样20μL。分别以羟苯甲酯和羟苯乙酯峰面积计算相对标准偏差(RSD)。结果羟苯甲酯峰面积的RSD为0.95%，羟苯乙酯峰面积的RSD为0.88%。

2.6重复性试验

取6份样品精密称定，按照上述方法测定。测得羟苯甲酯的平均含量为标示量的98.86±1.18(%)，羟苯乙酯的平均含量为标示量的98.12±1.27(%)。

2.7稳定性试验

分别在0、4、6、12、24h的时间取精密度项下的供试品溶液进样，记录色谱图。测得羟苯甲酯供试品溶液在24h内进样的相对标准偏差为1.48%，羟苯乙酯供试品溶液在24h内进样的相对标准偏差为1.36%。

2.8加样回收率试验

准确称取蛇油膏样品1.000g，分别按照标示量的80%、100%和120%加入羟苯甲酯及羟苯乙酯对照品甲醇溶液，方法同前，分别进行液相测量峰面积，计算回收率。

测得羟苯甲酯的平均回收率为：98.56±1.32%,羟苯乙酯的平均回收率为：98.92±1.24%。

2.9样品测定

取三个不同批号的样品，参照2.1项下“供试品溶液的制备”所述方法测定。样品测定结果见表。据此测定结果，按百分比计算，蛇油膏中羟苯甲酯、羟苯乙酯的含量约为0.2%、0.1%左右。

3.讨论

3.1样品的前处理

蛇油膏属于乳膏剂，其中油脂性成份相对较多。乳膏样品的前处理一般为选择破乳剂，和采用其它物理方法提取待测物质[2,3]。我们采用溶剂加热、超声波进行前处理，发现超声易导致提取药物后的溶液重新乳化。故采用加热法处理基质。加热后冰浴，可去除大部分基质成份，过滤除去后可大大减少带入液相色谱的基质成份，保证主药的检测受到的干扰较小[4]。

3.2检测波长和柱温的选择

羟苯甲酯、羟苯乙酯最大吸收峰均在256nm左右。故以此为检测波长。前期实验中发现，提高柱温保留时间略有减少。但在32℃以上改变不大。因此，柱温采用32℃。

3.3流动相的选择

蛇油膏经提取后大部分基质成份被去除。但仍有少量其它物质存在于提取液中。前期研究中曾参照文献中报道的方法来测定羟苯甲酯和羟苯乙酯，发现这些方法均不适合于本基质[5]。前期实验中曾采用梯度洗脱测定样品，但需耗时40min左右。考虑到羟苯甲酯、羟苯乙酯均具有酚羟基，有一定的酸性，在提取液中加入碱性物质可能有利于与其它物质分离。我们在甲醇提取后的溶液中加入氨水，发现有少量沉淀析出。而羟苯甲酯、羟苯乙酯在上述体系中溶解度良好。在随后的测定中发现，经甲醇滴加氨水处理后的溶液仍有极少量微小杂峰出现，测定一个样品须25min左右。为缩短分析时间，我们通过反向思维，减少流动相中甲醇比例，流动相比例设为甲醇：0.1%醋酸=47:53。在这一条件下，微量杂质保留在柱上，在色谱图上不出峰。这样分析时间缩短至15min左右。微量杂质可在检测若干批样品后再冲洗色谱柱而去除，不会影响色谱柱的使用。此法测定蛇油膏中的羟苯甲酯、羟苯乙酸简便、快速，准确。

【参考文献】

[1]刘浩然，张会杰，穆卓，等.HPLC法测定咪松酚乳膏中硝酸咪康唑、醋酸地塞米松及丹皮酚的含量[J].湖南大学学报（自然科学版），2011，38(8):55-57.

[2]李蔚，马嘉，吴静，等.HPLC法测定糠酸莫米松乳膏含量[J].安徽医药，2014，18(10):1854-1856．

[3]陈艳玲，刘浩然，吴成新，等.HPLC法同时测定复方硝酸咪康唑乳凝胶中硝酸咪康唑及蛇床子素的含量[J].湖南师范大学学报(医学版)，20ll，8(4):84-86.

[4]闫妍，刘永明，朱晓琼.HPLC法同时测定对羟基苯甲酸酯类及对羟基苯甲酸含量[J].中国药物评价，2014，31(2):82-85.

[5]孙燕，蒋培培，高旭，等.建立RP-HPLC法测定羟苯甲酯和羟苯乙酯的含量[J].军事医学，2014，38(9):751-752.