探讨荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

探讨荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

石强

(山西省晋中市疾病预防控制中心山西晋中030600)

【摘要】目的：本文就荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用价值进行分析与探究。方法：选择我市第一人民医院2014年5月—2016年7月期间收治的住院患者100例，其后对所有患者的临床标本予以回顾性分析，所有患者均接受荧光定量PCR技术，最后对微生物检测结果进行总结。结果：通过对本组患者的临床标本回顾性分析可知，脓液标本中5株为金黄色葡萄球菌，大便标本中24株沙门氏菌，1株为O157：H7，10株为副溶血性弧菌。结论：在临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术，具有较高的灵敏度和特异性，因此该检测手段可以在临床上更进一步的实践与应用。

【关键词】荧光定量PCR技术；微生物检测；应用价值

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）28-0124-02

以往的PCR技术存在诸多问题，机械化程度相对较低[1]。近年来，医疗技术的进一步发展，荧光定量PCR技术应运而生，并且广泛应用于临床。该检测手段具有较高的特异性和敏感性，在PCR反应体系中将荧光基因加入，利用荧光信号累积，对整个阶段进行监测，最后以定量分析法为主对未知模板进行分析，从而提高临床检测精准度[2]。本次研究为探究该检测手段的临床价值，选择我院2014年5月—2016年7月期间收治的住院患者100例，其后对所有患者的临床标本予以回顾性分析，以下为所得数据和过程。

1.临床资料与方法

1.1临床信息

本次研究共抽取住院患者100例，入选年份为2014年5月—2016年7月。本组患者中，男性患者60例，女性患者40例，最大年龄为80岁，最小年龄为20岁，经统计后中位年龄为（46.5±5.2）岁。其中20例患者为泌尿系统感染，12例患者为细菌性食物中毒，48例患者为上呼吸道感染，10例患者为流行性感冒，8例患者为肾俞肾炎，2例患者为慢性阻塞性肺病。本组患者的临床标本中，60份为粪便，40份为脓液。

1.2方法

本组所有住院患者的临床标本检测手段以荧光定量PCR技术为主，将样本增菌液滴入灭菌Epp中，样本量为1.5mg，充分混匀后进行高速离心，时间为2分钟。待上层完全清除后，将DNA提取液加入剩余沉淀中，剂量为100μl，混匀后进行放置沸水浴中，时间约为10分钟[3]。其后进行高速离心，时间为5分钟，取出上层，样本量为4μl，待操作完成后实施PCR反应。首先将PCR检测仪进行充分准备，而后依据相关流程和说明书将混合液进行准确配制，在此期间，需将仪器参数进行合理设置，如：循环参数、阴性对照及阳性梯度模板，最后在对所得结果予以判定时，需遵循检测仪和试剂盒说明予以明确。待完成微生物菌分离后，分别选取5株菌株进行相关检测，若菌株的检测结果显示为阳性，需进行进一步操作，即梯度稀释，倍数为10倍，最后依据试剂盒说明书对PCR进行扩增，并对试剂盒的灵敏性进行总结。

2.研究结果

本组100例住院患者行荧光定量PCR技术检测，粪便标本共计60份，结果显示为：24株沙门氏菌，占比为40.0%，1株为肠出血性大肠杆菌O157：H7，占比为1.7%，10株为副溶血性弧菌，占比为10.7%；脓液标本共计40份，结果显示为：5株为金黄色葡萄球菌，占比为12.5%。

其后选取粪便中的菌株，即：沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌和副溶血性弧菌，脓液中的金黄色葡萄菌菌株，所有菌株为阳性，数量分别为5株，依据试剂盒检测特异性，最终结果显示为：特异性比例为100%，未出现假阳性和假阴性。

对粪便中和脓液中的菌株进行检验，如：沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、副溶血性弧菌及金黄色葡萄菌菌株，依据PCR技术进行检测，倍数放至10倍，最终结果表明：102拷贝/ml核酸样本可以作为检测限度，且该数据是最低标准。

3.讨论

3.1PCR原理

以往的PCR只能作为定性，在实际操作中，产物扩增后需分析凝胶电泳后的片段。定量PCR在反应体系中需将荧光基团加入，通过累积荧光信号予以监控，将初始模板的定量予以完成，而后分析未知模板。与此同时，荧光染料标记物及探针标记物通过PCR延伸产生荧光物质，在循环期间会放大荧光信号，随后利用仪器对荧光中的物质进行检测，并将初始模板数量予以计算。由此可见，在荧光定量PCR检测中，需实时连续对整个反应进行检测，从而将模板最初量予以推断。

3.1病毒检测

从目前的病毒检测手段来看，临床常选择荧光定量PCR技术，与此同时该技术手段取得了临床上的高度认可。就B型肝炎病毒来说，实施荧光定量PCR检测，检测对象具有多样性，可以将不同基本型混合作为依据，这样一来，所有混合基因型均可检出，从这一研究结果可以看出，在病毒检测中使用荧光定量PCR技术精确度相对较高[4]。

3.2细菌

医疗技术日新月异的发展，荧光定量PCR技术凭借诸多优势广泛应用于临床各个领域的检测中，与此同时使分枝杆菌法应运而生，据相关资料显示，该检测手段具有较高的灵敏度，占比高达90%，与此同时，该方法的特异性也相对较高，占比高达100%。与以往的图片染色法和培养法进行比对，荧光定量PCR技术灵敏度和特异性比例明显较高。除此之外，就沙门式菌的ompF基因来说，实施荧光定量PCR技术检测，可以有效检出不同类种型，与此同时灵敏度和特异性比例也相对较高[5]。使用荧光定量PCR技术还可以缩短检测时间，在一定程度上使检测效率得以明显提升。据相关学者研究指出，该学者对引物的特异性和敏感性进行研究，同时将10余种肠道细菌进行分析，分别予以定量PCR检测和常规PCR检测，结果表明：定量PCR的检测灵敏度比例较高，且时间也相对较短。

3.3真菌

近年来，在真菌检测中，临床逐渐引入荧光定量PCR技术，尤其是曲霉菌的18SENA序列，与此同时在探针检测中也应用较为广泛，该方法通过对疑似样本进行检验，和特异性测试，其结果显示为100%，由此可以看出，在真菌中使用荧光定量PCR技术具有较高的准确率。

从目前来看，荧光定量PCR检测手段可以在部分微生物检测中广泛应用，如：FDA和CFDA。近年来，该检测手段不断发展和完善，在多种微生物检测中广泛应用，并取得了临床上的高度认可。与此同时，荧光定量PCR技术具有较高的灵敏度和特异性，检测速度也相对较快，操作相对便捷。从本次研究结果可以看出，通过对本组患者的临床标本回顾性分析可知，脓液标本中5株为金黄色葡萄球菌，大便标本中24株沙门氏菌，1株为O157：H7，10株为副溶血性弧菌。这一研究结果充分体现该检测手段的特异性和灵敏度。

综上所述，结果进行分析和总结可知，在临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术，具有较高的灵敏度和特异性，可以在临床上更进一步的实践。

【参考文献】

[1]李春娟，张一兵，罗喜钢等.荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用[J].生物技术通报，2011(2):66-69.

[2]王宇，靳伟东，兰凯等.荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用[J].中国卫生标准管理，2015(30):151-152.

[3]郑胜男.三种小儿常见病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[D].山东大学，2013.

[4]实时荧光定量PCR[J].生物产业技术，2014(6):91-91.

[5]董永康，王秀娥.荧光定量聚合酶链反应检测石蜡组织结核杆菌的研究[J].中国药物与临床，2015(2):183-184.