维生素D基因多态性与脑梗死病因亚型的关系

维生素D基因多态性与脑梗死病因亚型的关系

刘永胜孙菲刘梦蕙

（齐鲁医药学院山东淄博255188）

【摘要】目的：探讨生素D结合蛋白(vitaminDbindingprotein，DBP)和生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)基因多态性与中国山东地区脑梗死病因亚型的相关性，并进一步探讨相关遗传因素与动脉粥样硬化颅内外选择性损害之间的关系。方法：按照TOAST病因分型选取272例大动脉粥样硬化(Large-arteryatherosclerosis，LAA)型脑梗死患者（LAA组按照脑动脉狭窄部位分为颅内/颅外/颅内外三组）、87例小动脉闭塞性脑梗死(smalllacunar，SAO)患者及175例同期非脑梗死人群（对照组）。从VDR基因和DBP基因中分别选取2个代表性的单核酸多态性位点VDR基因[SNPs，rs2228570、rs1544410]和DBP基因[SNPs，rs4588、rs7041]，用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行检测。结果：所检VDR基因的2个SNPs中，rs2228570的基因型频率在SAO组与对照组经logistic回归分析纠正混杂因素（吸烟、饮酒、糖尿病、高密度脂蛋白、hs-CRP、GLU、TC）后差异有显著性[P=0.026，OR（95%CI）=2.48（1.117～5.508）]，进一步纠正高血压后，虽然差异性仍有统计学意义，但显著性较前减弱[P=0.048,OR（95%CI）=2.309（1.006～5.299）]；进一步统计发现，rs2228570在SAO组中ff基因型频率显著高于对照组（35.29％：19.64％），差异有统计学意义（P=0.03）；所检DBP基因中的rs4588基因型频率，在LAA组与对照组纠正所有混杂因素后比较仍有统计学意义[P=0.001，OR（95%CI）=2.852（1.562～5.207）]。其它两个位点（rs1544410、rs7041）的基因型及等位基因频率分布在病例组（LAA组及SAO组）与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：（1）rs2228570基因多态性与SAO型卒中相关，机制可能与此多态性使人群对高血压易感有关。（2）rs4588等位基因A与LAA型脑梗死发病相关。

【关键词】脑梗死动脉粥样硬化；25(OH)DDBPVDR；多态性单核苷酸；rs4588rs2228570

【中图分类号】R743.33【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2019）01-0125-02

本实验即选择VDR/DBP基因作为候选基因，比较缺血性卒中不同亚型与健康对照者之间VDR[SNPs，rs2228570、rs1544410]和DBP[SNPs，rs4588、rs7041]位点等位基因和基因型频率是否存在差异，探讨VDR、DBP基因多态性与缺血性卒中发病及其危险因素之间的关系。

1.资料和方法

1.1研究对象

病例组为2013年8月至2014年8月青岛大学附属医院神经内科诊疗的急性脑梗死患者。按急性卒中治疗org10172试验（TOAST）分型选取LAA型脑梗死272例，SAO型脑梗死患者87例，分别按照血管床选择性损害的不同进一步分为：单支和多支动脉狭窄组。入组标准：全部患者均经颅脑CT、CTA和（或）MRI、MRA证实有脑梗死，并行经颅多普勒（TCD）、或DSA、心脏超声等检查明确脑血管和心脏病变情况。排除标准：心源性栓塞，其他病因或不明原因型卒中，严重心脏疾病及近期发生心肌梗死，心绞痛疾患及严重感染，严重肝、肾功能不全，血栓性疾病，肿瘤，服用抗凝、抗血小板药物者。

对照组为健康体检和同期住院的非脑梗死患者共175例，其性别、年龄与病例组相匹配。入组标准：既往无卒中病史，颅脑CT或MRI证实无脑梗死灶，经颅多普勒超声、颅脑MRA或颈部CTA等检查证实无脑血管病变。排除标准：同病例组。

本研究获得医院伦理委员会的批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2SNPs的选择

从维生素D通路基因中选取了4个代表性基因位点：VDR基因[SNPs，rs2228570、rs1544410]和DBP基因[SNPs，rs4588、rs7041]。因rs2228570有4个等位基因[A/C/G/T]，只有当野生型T存在时是FokI的酶切位点，为便于表示，用f代表内切酶能够识别的等位基因T，用F代表FokI无法识别的等位基因[A/C/G]。其余位点皆用其本身的等位基因表示。

1.3方法

资料收集：采集所有参与者的既往史、个人史资料，其中卒中危险因素包括高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症以及吸烟饮酒史等。各种危险因素的定义如下：（1）高血压：收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg；（2）糖尿病：空腹血糖≥7.0mmol/L，餐后2h血糖≥11.1mmol/L或任意时刻血糖≥11.1mmol/L，并且有典型糖尿病症状；（3）高脂血症：总胆固醇和（或）甘油三酯浓度超过正常高限；（4）冠状动脉粥样硬化性心脏病：经心电图及心脏彩超确诊；（5）吸烟：纳入研究前5年内≥10支/d；（6）饮酒：酒精摄入量平均＞24g/d。

标本采集：清晨采5ml空腹前臂静脉血置于EDTA抗凝管中，4℃保存，静置2h后常温下3000r/min离心10min分离出血浆，留取血细胞于-80℃冰箱冻存。应用非离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取白细胞内DNA，置于-20℃冰箱保存待用。

基因多态性片段扩增：基因序列参考GenBank，并经BLAST比对分析。引物由上海生工公司合成。使用美国AppliedBiosystems2720PCR扩增仪，TaKaRaLATaqwithGCBuffer反应试剂进行PCR扩增。总反应体系25ul：DNA模板4μl，LATaq酶1μl，2XBuffer12.5μl，dNTPMixture4μl，上下游引物各4μl（10μmol/L），加双蒸水至25μl。PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，rs2228570、rs1544410、rs4588、rs7041分别以60℃、60℃、59℃、59℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min。反应完成后，取4μlPCR产物，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，90V电压20min，使用上海天能Tanon4200SF全自动荧光/化学发光成像分析系统观察。

基因型鉴定：取PCR扩增产物4μl，向其加入限制性内切酶（NEB公司）（rs2228570、rs1544410、rs4588、rs7041分别对应FokI、BmsI、styI、HaeIII）1μl，10×Buffer2.5μl，加双蒸水至8ul，于37℃恒温水浴消化1小时。取酶切产物4μl，于2%琼脂糖凝胶电泳，90V电压40min，使用上海天能Tanon4200SF全自动荧光/化学发光成像分析系统观察并拍照。

1.4统计学方法

以哈迪-温伯格平衡检验观察样本是否具有群体代表性。P＜0.05定义为差异有统计学意义。采用SPSS16.0（SPSSforWindowsversion16.0，美国）统计学软件进行基础分析：符合正态分布的计量资料以（x-±s）表示，组间计量资料比较采用t检验或完全随机设计的单因素方差分析；不符合正态分布资料以M±Q表示，组间资料采用秩和检验分析；计数资料比较采用χ2检验或者Fisher精确检验对组间计量资料、基因型和等位基因频率分布进行分析。基因型和等位基因风险率采用相对危险度（oddsratio,OR）表示。

2.结果

2.1一般临床资料的比较

三组人群的平均年龄、性别组成、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平比较差异无统计学意义；但病例组的高血压、饮酒及糖尿病患者所占比例患者比例明显多于对照组（P＜0.05），高密度脂蛋白水平低于对照组（P＜0.01）。

2.2卒中亚组与对照组25（OH）D基因多态性的比较

2.2.1对照组各基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡（P＞0.05），样本具有人群代表性。

2.2.2rs2228570基因型频率的分布在SAO组与对照组之间的差异有统计学意义（P=0.033），rs4588位点基因型频率分布在LAA组与对照组差异有统计学意义（P=0.001）；rs4588位点的等位基因A在LAA组所占比例高于对照组（31.07%vs24.38%），但差异无统计学意义（P=0.068）。其它两个位点（VDR基因的rs1544410位点；DBP基因的rs7041位点）的基因型及等位基因频率分布在病例组与对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.3根据缺血性卒中发病与等位基因显隐性关系，将理论上控制表型的位点基因型分为如表8二种模型。rs2228570位点的ff基因型在SAO组所占百分比显著高于对照组（35.29%vs19.64%），差异有统计学意义（P=0.03）。SAO组患者中，携带ff基因型的患者同时患有高血压的比例明显高于FF+Ff基因型（83.33%vs54.5%），差异有统计学意义（P=0.010）[5]。经logistic回归分析纠正混杂因素（吸烟、饮酒、糖尿病、高密度脂蛋白、hs-CRP、GLU、TC）后P=0.03，继续纠正高血压后P=0.04；rs4588中CA/AA所占百分比在LAA组高于对照组（61.165%vs44.628%），差异有统计学意义（P=0.004）[6]，在纠正混杂因素（吸烟、饮酒、糖尿病、高密度脂蛋白、hs-CRP、GLU、TC、高血压）后仍有统计学意义（P=0.001）[7]。其它基因型在三组间比较未见统计学意义（P＞0.05）。

2.325（OH）D基因多态性与颅内外动脉粥样硬化血管损害的相关性分析

LAA组的rs4588位点的基因型频率与对照组比较差异有统计学意义,若进一步将LAA组按大动脉狭窄（大动脉直径狭窄50%以上）支数及所在区域分为颅内单、双、多支的比较及颅内、颅外的比较，结果均未见统计学意义。见表1。

表1rs4588与动脉粥样硬化颅内外选择性的相关分析（例）

3.讨论

我们的研究发现rs4588基因型CA/AA频率分布在LAA组与对照组比较差异有统计学意义（P=0.01），由此本实验结果支持以下2种推论：（1）rs4588基因型CA/AA的存在可能使得DBP生成增多，导致具有生物活性的25（OH）D相对减少，使携带者对缺血性卒中易感。（2）rs4588CA/AA基因型的存在可能使得DBP产生过剩，导致未结合25（OH）D的游离DBP相对增多。因游离的DBP除了具有结合25（OH）D的经典作用外，还可能诱导血管损伤时平滑肌细胞的增殖和迁移，从而导致动脉粥样硬化的发生和发展。我们认为第二个推论能更加明确的解释我们的实验结果：rs4588CA/AA基因型使得DBP生成增多，如果同时存在维生素D不足，便使得游离的DBP相对增多，导致血管损伤，粥样硬化发生，进而使得LAA型卒中易感。本研究未发现rs7041位点的基因型与缺血性卒中相关。

本研究未发现所研究的基因多态性在颅内外存在显著差异，提示其对颅内外动脉狭窄不具选择性。

我们在国内首次将25（OH）D基因型与缺血性卒中的不同亚型（LAA及SAO亚型）进行研究，明确具体基因型与具体卒中亚型的关系（rs4588基因型与LAA型卒中相关，rs2228570与SAO型卒中相关）。今后我们可以通过测定血清25（OH）D、DBP的水平，同时评价卒中发病与基因多态性及25（OH）D、DBP水平之间关系，而后两者关系方面的大型研究已经在中国汉族人群进行并完成；更多的25（OH）D基因位点（如Taq、ApaI等）值得进一步研究。

【参考文献】

[1]Traylor,M.,etal.,Geneticriskfactorsforischaemicstrokeanditssubtypes(theMETASTROKEcollaboration):ameta-analysisofgenome-wideassociationstudies.LancetNeurol,2012.11(11):p.951-62.

[2]Chaudhuri,J.R.,etal.,Serum25-hydroxyvitaminDdeficiencyinischemicstrokeandsubtypesinIndianpatients.JStroke,2014.16(1):p.44-50.