胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+调节性T细胞的检测及临床意义

胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+调节性T细胞的检测及临床意义

奉林仇俊兰

奉林仇俊兰

（苏州市立医院北区肿瘤内科?215000）

【摘要】目的分析胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+调节性T(Treg)细胞的比例，并探讨其临床意义。方法通过免疫荧光术及流式细胞仪检测50例胃癌患者及50例健康对照组外周血CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞、CD4+CD25highT细胞、CD4+T细胞及CD4+CTLA-4+T细胞。结果两组比较，胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞、CD4+CD25highT细胞及CD4+CTLA-4+T细胞显著增多（P<0.05），CD4+T细胞显著减少（P<0.05）。结论胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞显著高于健康对照者，可能与胃癌患者的免疫抑制和肿瘤进展相关。

【关键词】胃癌CD4+CD25highFOXP3+TregCD4+CD25highTCD4+TCD4+CTLA-4+T

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）28-0060-03

PeripheralRegulatoryCD4+CD25highFOXP3+TCellsinPatientswithGastricCancer

FengLin，QiuJunlan

【Abstract】Objects：TodemonstratethepossibleinvolvementofCD4+CD25highFOXP3+regulatoryT(Treg)cellsinimmunesystemimpairmentinpatientswithgastriccancer.Methods：TheCD4+CD25highFOXP3+Tregcells、CD4+CD25highTcells、CD4+TcellsandCD4+CTLA-4+Tcellswereanalyzedinperipheralbloodin50patientswithgastriccancer.Results：Comparedwithhealthycontrols，patientswithgastriccancerhadhigherpercentageofCD4+CD25highFOXP3+Tregcells、CD4+CD25highTcellsandCD4+CTLA-4+Tcells，hadlowerpercentageofCD4+Tcells.Conclusions：TheincreasedpercentofCD4+CD25highFOXP3+Tregcellsmayberelatedtoimmunosuppressionandtumorprogressioninpatientswithgastriccancer.

在我国，胃癌是发病率和病死率最高的人体恶性肿瘤之一。胃癌的发生是一个多因素、多阶段的过程。肿瘤免疫更是一个复杂的过程，其中的一个重要因素为机体免疫功能失调，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后。近年来，调节性T（Treg）细胞的发现，使人们对免疫耐受及免疫调节有了新的认识。Treg细胞来源于胸腺，是一种具有重要免疫调节功能的T细胞亚群，具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特点，在肿瘤免疫及自身免疫的调节中起重要作用。Treg细胞具有数种功能性标志分子，如表面功能标志分子细胞毒T淋巴细胞相关抗原（cytotoxicTlymphocyteantigen-4，CTLA-4）和叉状头/翅膀状螺旋录因子（transcriptionfactorforkheadboxP3protein，FOXP3）。转录因子FOXP3是Treg细胞的标志性调节基因，不仅是Treg细胞特异性的标志，更是活化的标志[1]，对这些细胞的发育和功能的诱导起关键作用。本研究采用流式细胞仪测定了胃癌患者的外周血中CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞、CD4+CD25highT细胞、CD4+T细胞、和CD4+CTLA-4+T细胞，以探讨其临床意义。

1资料与方法

1.1研究对象收集2012年1月至2014年10月来我科住院治疗的50例胃癌患者，其中男28例，女22例，年龄49-72岁，入组患者均经手术病理确诊，近一月未接受抗肿瘤治疗。另选择体检中心体检的50名年龄性别配对的正常人作为对照组。所有对象均无糖尿病、甲状腺功能亢进等自身免疫性疾病。

1.2主要仪器与试剂流式细胞仪为美国BD公司FACSCalibur。Anti-CD4-FITC-荧光单抗、Anti-CD25-APC-荧光单抗，CTLA-4PerCP、APC-Foxp3配套试剂，阴性对照为鼠IgG1-PE，IgG1-FITC和IgG1-APC，上述试剂均购自美国BD公司。

1.3CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞的测定两组均于空腹状态下抽取静脉血3ml，置于EDTA抗凝管，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，以PBS洗涤二次，调整细胞悬液浓度为1×106/ml。取上述EDTA抗凝全血100μl于专用流式试管中，分别加入CD25-APC、CD4-FITC、CTLA-4PerCP各10μl，室温避光孵育15min，加溶血素2ml避光10min，离心1500rpm/min，5分钟。弃上清，加入1mlPBS混匀，再次离心，1500rpm/min，5分钟，弃上清，加400μlPBS混匀，应用流式细胞仪检测，结果以FOXP3+阳性细胞占CD4+CD25highT细胞的百分率表示。同时，获取CD4+CD25highT细胞、CD4+T细胞和CD4+CTLA-4+T细胞。

1.4流式细胞术检测分析调用Cellquest软件获取、分析数据。以FSC-SSC散点图设淋巴细胞门，分别建立IgG1-FITC对IgG1-Percp、IgG1-FITC对IgG1-APC、IgG1-PE对IgG1-FITC散点图，分析其CD25、FOXP3的表达，结果以百分比表示。

1.5统计学处理所测资料应用SPSS17.0统计软件分析，两组均数进行方差齐性检验后，采用t检验，P<0.05有显著性差异。资料以均数加减标准差表示。

2.结果

2.1流式细胞仪检测示意图见图1。R1为淋巴细胞，CD4+T以R1设门，CD4+CD25highT、CD4+CTLA-4+T细胞以CD4+T设门、CD4+CD25highFOXP3+Treg以CD4+CD25highT细胞设门。

P值P<0.01P<0.05P<0.05P<0.05

3.讨论

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，是消化系统发病率最高的肿瘤。我国是胃癌的高发区，其发病率和死亡率均超过世界平均水平的2倍[2]。在生理状态下，机体免疫系统具有免疫监视作用防止肿瘤的发生。然而，癌症患者免疫系统对肿瘤抗原常表现为弱的免疫应答，从而不能有效清除肿瘤细胞，导致临床肿瘤的发生。这种对肿瘤抗原弱免疫应答的原因很可能是由于肿瘤抗原为变化了的自身抗原，因此，维持自身耐受的机制也在对肿瘤耐受发挥着作用，使之“逃逸”免疫监视。研究表明，正常情况下机体内Treg细胞的免疫学意义是维持机体免疫稳态，其作用方式是动态调节机体免疫平衡，有防止免疫反应无限制扩大及抑制自身免疫反应发生的作用。体内Treg细胞的数量和功能状态对机体免疫稳态的维持有重要意义，数量过少或功能不足，会出现相应的免疫性损害，甚至出现自身免疫性疾病，这种情况已在很多疾病中得到证实。但Treg细胞数量过多或功能过强的情况不多，目前还主要在肿瘤患者上有报道。

正常人外周血中Treg细胞约占CD4+T细胞的5%-10%，持续表达CD25分子，是一类具有免疫调节（或抑制）功能的T细胞亚群，能够抑制特异性CD4+T、CD8+T细胞以及NK细胞的免疫反应[3]，机体可以通过Treg细胞以“主动”方式维持自身免疫耐受。研究证实，在mRNA和蛋白水平上，外周表达FOXP3的CD4+T细胞主要是CD4+CD25highT细胞亚群。胸腺内FOXP3mRNA仅在CD4+CD25highCD8-腺细胞被检测到，而在CD4+CD25-CD8-细胞、CD8+CD4-细胞和其它未成熟的胸腺细胞中并未发现。在B细胞和CD8+的细胞中也未检测到FOXP3的表达[4]。

FOXP3是一种50kD的转录抑制因子，其特征性结构为蛋白C端的叉头翼状螺旋结构，定位于X染色体上，通过forkhead结构域与DNA特定位点结合，调节目的基因的活化与表达。FOXP3编码产物FOXP3蛋白是Treg细胞特异性标志，对Treg细胞的增殖分化及功能发挥起重要作用。研究表明，把FOXP3基因导入CD4+CD25-T细胞，这些细胞受刺激时就表现出与自然产生Treg细胞的无能/抑制表型，也能在体外抑制T细胞的免疫应答。因此，转录因子FOXP3在Treg细胞的发育和功能上是必需的，且区别于目前CD4+T细胞已有的分子标志如CD25、CTLA-4，这些标志不能将Treg细胞从活性T细胞、效应T细胞和记忆T细胞中区分开来。CTLA-4是一种抑制性调节分子，可能通过多种途径调节Treg细胞的功能。CTLA-4单克隆抗体或TGF-β1单克隆抗体单独应用时仅可部分抑制CD25+调节T细胞对CD25-细胞的抑制作用，而同时阻断CTLA-4和TGF-β1方可阻断Treg细胞的抑制功

能[5]。CTLA-4亦可与CD80和CD86结合，转导T细胞活化的抑制信号，从而抑制T细胞的活化、增值及免疫效应[7]。

CD4+CD25highT细胞可分为天然的CD4+CD25high

FOXP3+Treg和诱生的CD4+CD25highFOXP3-T细胞，CD4+

CD25highFOXP3-T细胞可在某些抑制性细胞因子(如IL24、

IL210或TGF2β)作用下分化为FOXP3+，发挥与CD4+CD25high

FOXP3+Treg相同的作用[6]。因此，在评价治疗肿瘤和自身免疫性疾病的效果时，观察CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞数量的高低，比检测CD4+CD25highT细胞更有意义[7]。本文发现：胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞显著增多（P<0.01），CD4+CD25highT细胞亦高于健康献血者（P<0.05），CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞的变化较CD4+CD25highT细胞、CD4+T细胞及CD4+CTLA-4+T细胞更敏感，这些发现为肿瘤病人的免疫治疗提供了依据。FOXP3表达上调，可维持免疫耐受、抑制排斥反应和自身免疫性疾病；FOXP3表达下调，降低机体免疫耐受，可治疗肿瘤、器官移植及慢性病毒感染。对于肿瘤病人，我们可以通过抑制或者阻断FOXP3的表达，抑制调节性T细胞的功能，从而提高机体对肿瘤抗原的免疫应答。作为一种新的抗肿瘤手段，将具有非常重要的意义。

参考文献

[1]吕承刚，李永翔.胃肠道恶性肿瘤患者CD4+CD25+调节性T细胞的检测及意义.安徽医科大学学报，2012，47(7)：817-820.

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[4]LiuX，XuX，LinX，?etal.PTD-hFOXP3proteinactsasanimmuneregulatortoconverthumanCD4+CD25-TcellstoregulatoryT-likecells.JCellBiochem，?2012，113(12)：3797-3809.

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[6]OhkuraN，?HamaguchiM，?MorikawaH?，?etal.T?cell?receptor?stimulation-induced?epigenetic?changes?and?Foxp3?expression?are?independent?andcomplementary?events?required?for?Treg?cell?development.Immunity，?2012，37(5)：785-799.

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