兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料的制备及体外四环素释放规律研究

兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料的制备及体外四环素释放规律研究

桂平1黄宇文1陶树高2白植宝1

桂平1黄宇文1陶树高2白植宝1（广州市第一人民医院1.口腔科,2.检验科，广东广州510180）

基金项目:广东省科技计划项目(2008B030301003)

作者简介：桂平（1963-），男，硕士，主任医师。

【摘要】目的：制备兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料，并研究其体外释放规律。方法：将四环素和胶原蛋白包被于兔脱矿骨颗粒上，制备成兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料。采用紫外分光光度法，以水为溶质，每24小时计算累积释放的四环素量。结果：对于载低、中剂量的四环素复合材料，随着时间的延长，四环素的释放是个由快到慢，四环素的累积释放量与时间的平方根成线性关系，符合Higuchi方程。对于载高剂量四环素复合材料，四环素的前期释放速率明显快于其他两个释放体系。结论：本课题制备的兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料表现出良好的四环素缓释性能。

【关键词】兔脱矿骨;胶原蛋白;四环素;药物释放

【中图分类号】R927【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0157-02

植骨术是目前临床上用于修复骨缺损的重要方法，目前以同种异体骨制备支架材料，复合具有促成骨作用的生物活性因子以及具有缓释作用的生物兼容性材料，已经显示出了良好的应用前景[1,2]。四环素具有抗菌、抑制骨吸收以及促进成骨细胞增殖等药理学作用，Ⅰ型胶原蛋白作为黏附分子可以促进骨髓间充质干细胞的黏附和增殖，作为药物载体材料可以控制药物的缓释，所以本研究制备了兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料，并研究了此材料中四环素在体外的释放规律，为该材料在后面的动物实验提供理论依据。

1材料与方法

1.1兔脱矿骨制备:成年健康新西兰大白兔，气体栓塞处死，取双侧股骨和胫骨，去除结缔组织、骨膜、骨骺、骨松质和骨髓后，将皮质骨锯裁成1.5×0.5×0.5cm的骨条，1∶1氯仿-甲醇脱脂24h，0.6mol/L盐酸脱钙48h后，无水乙醇脱水。将长条骨粉碎成颗粒，过20目筛网，-70℃保存备用。

1.2兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料制备:1%四环素浓度（A组，载低剂量）复合材料制备：取盐酸四环素（sigma公司，美国）200mg，酸溶性的Ⅰ型胶原蛋白（amrseco公司，美国）500mg，充分溶于40ml0.05mol/L的醋酸溶液中，将制备的脱矿骨颗粒20g加入上述溶液中，充分混匀，分装后冷冻干燥，-70℃保存备用。然后分别取盐酸四环素500mg和1000mg按上述方法制备成：2.5%四环素浓度（B组，载中剂量）复合材料制备和5%四环素浓度（C组，载高剂量）复合材料。

1.3四环素检测方法的建立:采用紫外分光光度法。用双蒸水为溶剂制备浓度为0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml的盐酸四环素标准系列，采用UV-260紫外分光光度计（日本岛津），测定不同系列在356nm的吸光度，建立吸光度A356对应浓度C的回归方程[3]。

1.4兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料四环素体外释放测定:将A、B、C三组兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料各2g，分别置于10ml离心管中，加入4ml双蒸水作为溶出液，37℃静置恒温水浴，每隔24h将4ml溶出液全部取出，将固体材料洗净冷冻干燥，换上同等体积的37℃双蒸水继续溶出四环素。取出来的溶出液，以双蒸水为参比测定在356nm处的吸光度，根据上述建立的回归方程，分别计算其释放的四环素释放量。

2结果

2.1盐酸四环素的标准曲线及标准方程。标准方程：A356=-00268+0.0292x（r=0.9986，n=7）。从图1中可以看出，水溶液中四环素在356nm处的吸光度与它的浓度呈很好的线性关系。

2.2兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料中四环素的累积释放量与时间的关系:从图2中可以看出，对于载1%和2.5%四环素的复合材料，早期四环素的释放速率比较快，后期速度与前期比较，变得平稳，可以持续10天。从图3中可以看出，对于载5%四环素的复合材料，早期四环素的释放速率明显快于其他两个释放体系，后期速度明显变慢，趋于平稳。

2.3兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料中四环素的累积释放量与时间平方根的关系:从图4中可以看出，对于载1%和2.5%四环素的复合材料四环素的体外释放基本符合Higuchi方程，即四环素的累积释放量与时间的平方根成正比。从图5中可以看出，对于载5%四环素的复合材料，四环素的累积释放量同时间的平方根出现了折线关系。

3讨论

自体骨移植被认为是修复骨缺损的最佳治疗方案，但是必须开辟第二手术区进行取材，增加了患者的痛苦，限制了它在临床上的应用。近十年余来，随着骨组织工程学的迅猛发展，各种新颖的植骨材料的出现，为骨缺损修复开辟了新的思路。植骨材料不仅要满足临床使用时所要求的物理化学性质，还需要有良好的生物兼容性和促骨生成生物学活性。与化学合成材料相比，同种异体脱矿骨仍然维持着天然的网状结构，所以是较理想的支架结构材料。Ⅰ型胶原蛋白几乎没有什么抗原性，加上强力的黏附特性和多孔性，可以成为良好的药物缓释载体。四环素除具有抗菌作用外，还具有促进成骨细胞分化和增殖的作用，并有异位诱导成骨的作用[4-6]。本课题利用了四环素可吸附在矿物质和胶原膜上的特性，制备了兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料，以期作为新型生物衍生骨材料，观察其在兔模型上的生物学作用。

在本次实验中，我们研究了兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料四环素的释放规律，从结果中可以看出，对于载低、中剂量的四环素复合材料，随着时间的延长，四环素的释放是个由快到慢的过程，四环素的累积释放量与时间的平方根成线性关系。这符合Higuchi根据药物扩散机理推出的Higuchi模型[7,8]，方程如下：Q/A=2C0(Dt/π)1/2；Q/A:单位扩散面积药物扩散进入接收池的量,C0:凝胶中药物初始浓度，D:药物表观扩散系数，t:药物扩散的时间。这说明了对于载低、中剂量的四环素复合材料，四环素主要以物理吸附状态存在于胶原蛋白中，以物理扩散的方式进行释放。对于载高剂量四环素复合材料，四环素的前期释放速率明显快于其他两个释放体系，四环素的累积释放量同时间的平方根出现了折线关系，这说明了在释放前期，四环素的释放方式不是单一的扩散方式。这可能和四环素与钙离子有很强的螯合特性有关。当四环素与胶原蛋白的物理吸附处于饱和状态后，剩余的四环素可以同脱矿骨中残留的钙离子以1∶2的配比以化合物的形式存在[7]，这种螯合作用对载高剂量四环素复合材料中四环素的早期释放产生了重要的影响，形成了扩散与脱离溶解共同控制的释放体系。

从结果中可以看出，本课题制备的三种兔脱矿骨-胶原蛋白-四环素复合材料都表现出了很好的四环素缓释作用，可以维持10天以上。这就保证了，应用于动物实验过程中，四环素在材料周围始终维持比较高的浓度。

参考文献

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[2]刘牧菲.四环素骨诱导活性材料整复牙槽缺损的实验研究[J].口腔医学纵横杂志，2000，16（3）：190-193

[3]张胜强,杨明华,姚晓敏等.四环素控释药线的研究[J].中国药科大学学报,1998,29(1)∶36-38

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[6]梁军，辛景义，曹红彬.四环素-胶原生物衍生骨缓释材料修复骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（14）：2615-2618

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[8]HiguchiT.Mechanismofsustainedactionmedication:Theoreticalanalysisofrateofreleaseofsoliddrugsdispersedinsolidmatrices.JPharmSci,1963;52∶1145