钙调蛋白神经保护作用的体外研究

钙调蛋白神经保护作用的体外研究

刘宝莲

刘宝莲（山东省蒙阴县人民医院药剂科，山东蒙阴276200）

摘要：目的探讨钙调蛋白Calmodulin（CaM)神经保护的作用及相关机制。方法0.32mM异氟烷处理培养一周后的神经细胞12h，异氟烷处理前提前两天在培养基中加入钙调蛋白,将细胞随机分为溶剂对照组（control组）、异氟烷处理组（iso组）和异氟烷加钙调蛋白组（iso+CaM组），检测细胞的MTT，对细胞进行Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞并计数。结果control组的MTT值明显高于iso组和iso+CaM组（P<0.05）,凋亡细胞计数明显低于iso组和iso+CaM组（P<0.05）；iso组MTT值明显高于iso+CaM（P<0.05），凋亡细胞计数明显低于iso+CaM（P<0.05）。结论0.96mM的异氟烷处理2h对小鼠的神经元产生了明显的毒性；钙调蛋白能明显减轻异氟烷的神经毒性。

关键词：钙调蛋白；异氟烷；原代培养；神经元中国图书资料分类号文献标识码

钙调蛋白Calmodulin（CaM）是细胞内一种主要的Ca2+受体信号系统调控蛋白，CaM能够激活钙调蛋白依赖性的PDE、钙神经素、钙调蛋白激酶CaM-Kinase(CaMKs)。目前的研究发现钙调蛋白能够介导脑中CaMKs磷酸化并调节大量的蛋白底物，CaMKs在脑中含量极为丰富，CaMKs能调节神经递质的释放，对神经系统中突触的形成和神经行为等方面有重要作用1。近年来的许多研究发现了吸入麻醉药异氟烷的神经毒性作用，特别是其对发育中的动物神经系统的影响2。本实验采用神经细胞体外培养的方法，从细胞水平探讨给予CaM后对异氟烷神经毒性的影响，从而进一步确定CaM对神经细胞的保护作用。材料与方法

一、材料

SPF级孕16-17天的昆明小鼠，由第四军医大学实验动物中心提供。胎牛血清（杭州四季青）；Neurobasal培养基（美国Introgen）；0.25％胰酶、L-多聚赖氨酸、B27、双抗、MTT、DMSO、Hoechst33258染色液(美国Sigma)；异氟烷（美国Baxter）；其他试剂均为进口或市售分析纯；CO2培养箱（美国Revco）；二氧化碳培养箱(美国SHELL／JB)；XDS一1B倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司)；ElxS00酶标仪(德国Bio2tek仪器公司)。

二、细胞分组

分为:①对照组；②异氟烷0.96mM组;③异氟烷0.96mM+CaM5uM组;

三、小鼠大脑皮层神经元分离、培养

参考文献3的方法并做适当改进：选用怀孕16-17天的昆明小鼠，常规消毒后无菌条件下颈椎脱臼处死断头取脑，在预冷的D—Hanks液中解剖分离大脑皮层，解剖显微镜下去除脑膜和血管，D—Hanks液洗2～3次，剪成lmm×lmm×lmm左右的小块，0.25％胰蛋白酶37℃消化20min，取出吹打，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基终止反应。1000r／min离心5min，弃上清液，用D—Hanks液洗1次，再离心，弃上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调节细胞悬液浓度为5×105／ml，接种于经0.01％多聚赖氨酸包被过夜的培养板中，放入37C恒温的CO2培养箱内(95％空气和5％CO2，湿度85％～98％)培养。48h后全量换液。以后根据培养基颜色变化，每2～3d半量换液1次。细胞培养至7d，经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学法鉴定，神经元占全部细胞总数的80％以上，仅少数细胞是星型细胞和其它胶质细胞。取培养7d的神经细胞进行实验。

四、异氟烷溶液的配制

用改良的Blanck和Thompson法配制可溶解于培养基的异氟烷溶液.10mM的异氟烷溶液的配制方法：将130μL液体异氟烷(1-chloro-2,2,2-trifluoroethyldifluoromethylether;AbbottLaboratoriesInc.,ChicagoIL)加入103mLBSS中，100-mL容积的棕色容量瓶盛装。玻璃瓶塞封口防止气体扩散。配好的溶液在摇床上摇匀24h以充分溶解异氟烷。使用前迅速将30mL溶液倒入50mL聚丙烯离心管中，震荡5-10s制成日常储备液。用BSS将日常储备液稀释0.96mM来处理细胞。在以往的研究中，异氟烷在溶液中的稳定性取决于处理的样品（相同条件下处理30min）。用气相色谱技术证实异氟烷的浓度4。

五、四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetra—zolium，MTT)检测细胞活力

活细胞线粒体中的琥珀酰脱氢酶具有将MTT中的四氮唑环还原成一种蓝紫色的化合物（甲躜）的能力，甲躜的量与活细胞数成正比。在上述损伤结束时，加入MTT(终浓度为0.5mg／mL)，置CO2孵箱中继续培养4h后，轻轻吸去上清液，加入二甲基亚砜150ml，置于37C恒温振荡器内，待结晶充分溶解后，在酶标仪上检测560nm波长处的光密度值(opticaldensity，OD)。

六、Hoechst33258荧光染色凋亡细胞计数

细胞爬片用4℃4％多聚甲醛固定30min，0.01mMPBS洗三次后，滴加Hoechst33258染色液，染色10min。PBS洗片后，用滤纸沾去多余液体。在荧光显微镜紫外光激发条件下进行观察、拍照。每个处理组选择20个清晰的高倍视野进行凋亡神经细胞计数。

七、统计学分析

采用SPSS13.0对数据资料进行统计学分析，数据以均数±标准差（±S）表示,进行方差分析和t检验，多样本均数间的比较采用One-wayANOVA检验,组间比较t检验。P<0.05有统计学意义。

结果

一、细胞活力

与control组相比，iso组的MTT值明显降低（P0.05，图1）；iso组MTT值明显低于iso+CaM组（P0.05，图1）。

图1各组细胞MTT值占对照组的百分比

Fig1ThepercentageofMTTofthecontrolgroupindifferentgroup

*P<0.05,vscontrolgroup

#P<0.05intreatmentgroupasdeterminedbyANOVA,followedbyDunnett’smultiple-comparisonstest

二、凋亡细胞形态及百分比

荧光显微镜下，观察到iso组的凋亡细胞明显增多（图3），凋亡神经细胞计数结果显示，iso组的凋亡细胞数明显多于control组，iso+CaM组的凋亡细胞数明显少于iso组，差异均具有显著性（P＜0.05，图4）。

图2荧光染色各组细胞凋亡情况(Hoechst33258,×400)

Fig2Hoechst33258staining:ApoptoticcellsindifferentgroupA：Almostnoobviousapoptoticcellsincontrolgroup;B：Isofluraneneurotoxicityinducedapoptosisinsomecells;C：Isoflurane+CaMtreatmentreducedneuronalapoptosisinducedbyisoflurane.

图3各组凋亡细胞计数

Fig3Apoptoticcellcountindifferentgroups

*P<0.05,vscontrolgroup

#P<0.05intreatmentgroupasdeterminedbyANOVA,followedbyDunnettsmultiple-comparisonstest

讨论

近二十年来，神经保护的研究一直是一个热门的话题。脑损伤可以直接或间接导致神经元凋亡、坏死，从而引起患者产生包括认知、运动在内的各种神经功能障碍，重者危及生命。目前临床上虽有很多神经保护药物和措施，但大多机制都不甚明确，这提示我们寻找针对脑损伤有效地神经保护方式及其机制研究将具有重要意义。

钙调蛋白是一种很重要的受体蛋白，它是15kD的蛋白，几乎存在于一切真核细胞。脑胞液钙调蛋白浓度为30-50mol/L。每个钙调蛋白分子含有4个结合域，结合的kD约为mol/L，在静息Ca2+浓度下，很少有Ca2+结合到上。有许多与Ca2+通路的相互作用是由钙调蛋白实现的，例如，脑内含有钙调蛋白敏感及不敏感的腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的同功酶。当Ca2+浓度上升到微摩尔级时，4个结合位点被占领，而钙调蛋白就成为一个多功能激活者5。Ca2+/CaM调节许多其他蛋白的功能活动，其中包括几个蛋白激酶。其中基因与动物的学习和LTP（长时程增强）都有关联，并在突触形成和记忆活动中有重要作用6。发育中的神经元在突触形成、树突分化和重塑活动被干扰时，可以激活导致细胞死亡的传导路径。突触快速形成的阶段是最易受损伤的时期。CaM有可能通过激活CaMKⅡ等激酶阻滞了细胞死亡传导通路的某一环节，从而促进了神经元突的发育和分化，进而减轻了异氟烷的神经毒性，发挥了其神经保护作用7。

本实验中我们采用检测神经细胞活力及凋亡细胞染色技术，重点观察了异氟烷的神经毒性作用以及CaM对异氟烷神经毒性的影响。检测结果显示，0.96mM的异氟烷溶液作用于小鼠的神经细胞12h后能对神经细胞产生了明显的毒性作用，而在培养基中提前加入CaM能明显减轻异氟烷的神经毒性。本实验主要探讨了异氟烷对体外培养的神经细胞产生的毒性作用及相关机制，重点观察了了加入CaM后对异氟烷神经毒性的影响。有关CaM的神经保护作用及吸入麻醉药物的神经毒性相关作用机制有待进一步研究。

参考文献

1.梁婧.钙调蛋白的研究进展[J].临床口腔医学杂志,1003—1634(2010)08—0500—02

2.MBoyceandJYuan.Cellularresponsetoendoplasmicreticulumstress:amatteroflifeordeathJ.CellDeathandDifferentiation(2006)13,363–373

3.WANGQiu-jun,LIKe-zhong,YAOShang-long,etal.DifferenteffectsofisofluraneandsevofluraneoncytotoxicityinprimarycorticalneuronsofratsJ.ChinMed2008;121(4)：341-346．

4.Wise-FaberowskiL,AonoM,PearlsteinRD,etal.Apoptosisisnotenhancedinprimarymixedneuronal/glialculturesprotectedbyisofluraneagainstN-methyl-D-aspartateexcitotoxicityJ.AnesthAnalg.2004Dec;99(6):1708-14．

5.CharlesCFinkandTobiasMeyer.MolecularmechanismsofCaMKIIactivationinneuronalplasticityJ.CurrentOpinioninNeurobiology2002,12:293–299

6.ZhongW,DongZ,TianM,etal.OpiatewithdrawalinducesdynamicexpressionsofAMPAreceptorsanditsregulatorymoleculeCaMKIIalphainhippocampalsynapsesJ.LifeSci.2006Jul24;79(9)：861-9．

7.WilliamA.Catterall1andAlexandraP.Few.CalciumChannelRegulationandPresynapticPlasticityJ.Neuron.2008.09.005