土牛膝中齐墩果酸的正交提取工艺研究

土牛膝中齐墩果酸的正交提取工艺研究

邓延秋银胜高（通讯作者）应露张欢

广西中医药大学广西南宁530001

【摘要】目的正交优化土牛膝中齐墩果酸的提取工艺。方法采用单因素考察实验、正交试验设计和高效液相色谱法，色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈：水=61：39；检测波长为10nm；流速为1ml/min；柱温为35℃的条件下对土牛膝中齐墩果酸的提取工艺进行研究。结果齐墩果酸在0.382-7.64μg范围内线性有良好线性关系，齐墩果酸标准曲线方程为：Y=530.76X，r=1.0000。土牛膝中齐墩果酸最佳提取工艺为每1.0克土牛膝粉末用20ml的50%乙醇超声提取30min。结论该提取工艺简便、合理，可为土牛膝中齐墩果酸的制备及土牛膝的进一步开发利用提供参考。

【关键词】土牛膝；齐墩果酸；正交设计；HPLC；提取工艺

StudyonorthogonalextractiontechnologyofoleanolicacidfromAchyranthesasperaL

YanqiuDengShenggaoYin*LuYingHuanZhang

（1.GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning，Guangxi530001）

Abstract：objectivetooptimizetheextractionprocessofoleanolicacidfromAchyranthesbidentata.Methodssinglefactorinvestigationexperiment，orthogonaldesignandhighperformanceliquidchromatographywereused.TheextractionprocessofoleanolicacidfromAchyranthesbidentatawasstudiedatthecolumntemperatureof35℃，thechromatographiccolumnwasAgilentEclipseXDB-C18（250×4.6mm，themobilephasewasacetonitrile：water61：39，thedetectionwavelengthwas10nm，theflowratewas1ml/min，andthecolumntemperaturewas35℃.Resultsthelinearrangeofoleanolicacidwas0.382-7.64μg，andthestandardofoleanolicacidwasobtained.Thecurveequationis1.0000.TheoptimumextractionprocessofoleanolicacidfromAchyranthesbidentataisasfollows：1.0gofAchyranthesbidentatapowderisextractedwith50%ethanolof20mlfor30min.ConclusiontheextractiontechnologyissimpleandreasonableandcanbeusedasreferenceforthepreparationofoleanolicacidinAchyranthesbidentataandthefurtherdevelopmentandutilizationofAchyranthesbidentata.

Keywords：Achyranthesbidentata；oleanolicacid；orthogonaldesignHPLC；extractionprocess

土牛膝出自《本草图经》，别名杜牛膝。本文研究的土牛膝为苋科植物粗毛牛膝（AchyranthesasperaL．）的干燥根和根茎[1]。其具有活血散瘀，祛湿利尿，清热解毒之功效，主要用于淋病，血尿，经闭，风湿关节痛，脚气，水肿，痢疾，疟疾，白喉，痈肿，跌打损伤[2-3]。现代医学研究证明，土牛膝具有改善机体微循环，调整新陈代谢，改善免疫功能等作用；且具有明显的抗炎抗菌作用、镇痛作用、抗衰老等作用[4-6]。本文拟对土牛膝中的齐墩果酸进行正交提取工艺研究，具体如下：

1实验试药与仪器

1.1实验材料

本实验所用的土牛膝根和根茎于2015年采集于重庆樟县，经广西中医药大学药学院廖月葵高级实验师鉴定为苋科植物粗毛土牛膝AchyranthesasperaL．的根和根茎；齐墩果酸对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：130425，纯度：HPLC≥98%）。

1.2实验仪器

L600台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；HWS-2l电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司），Agilent-No.7（1260）（Agilent美国安捷伦）；等等。

1.3试剂与溶剂

乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（实验室自制），其它试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1对照品溶液制备

精密称取干燥恒重的齐墩果酸19.1mg，转移至25mL容量瓶中，加适量水溶解，加水稀释至刻度，摇匀，配成浓度为0.764mg/mL的齐墩果酸标准溶液，备用。

2.2供试品溶液制备

取土牛膝药材粉末约1.0g（过50目筛），精密称定，置锥形烧瓶中，加入30%乙醇20ml，称定重量，静置0.5h后超声处理1.5小时，用乙醇补足重量，移入离心管中离心30min，上清液以乙醇定容至25ml，取1ml，加入20%盐酸10ml，称定重量，超声处理1小时，以乙醇补足重量，离心，上清液水浴烘干，以甲醇定容至10ml，摇匀，取1ml试液离心15min（转速13000rpm），即得供试品溶液。

2.3色谱条件

色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈：水=61：39检测波长：210nm；进量体积：10μl；流速：1ml/min；柱温：35℃。

2.4系统适应性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1至图2所示。结果表明：齐墩果对照品出峰处无干扰。

图2土牛膝样品高效液相色谱图

2.5标准曲线绘制

分别精密吸取齐墩果酸对照品溶液（0.764mg/mL）0.5、1、2、3、5、10μl，注入液相色谱仪，按上述2.3项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积Y对进样量X（μg）进行回归，得标准曲线方程：Y=530.76X，r=1.0000。表明齐墩果酸在0.382-7.64μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6提取溶液的考察

取1g土牛膝药材粉末（过24目筛），精密称定，分别置50ml的具塞锥形瓶中，分别精密加入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、40%乙醇、30%乙醇、20%乙醇、10%乙醇、纯水20ml，各提取溶剂均一式两份，称定重量，超声1小时，补足重量，将上清液倒入离心管中离心30min，上清液移至25ml容量瓶中定容，精密吸取10ml置入锥形瓶中，加入20%盐酸溶液10ml，称定重量，超声1小时，补足重量，摇匀，置入蒸发皿中，水浴烘干，以甲醇定容至10ml容量瓶中，摇匀，静置，取1ml，离心15min，即得供试品溶液。

实验数据表明30%、50%、80%三个浓度的乙醇提取土牛膝中齐墩果酸的效果较好，因此选用这三种溶剂进行正交实验。

2.7正交优化研究

以土牛膝中齐墩果酸为考察指标，以提取液体积（ml）、乙醇浓度（%）、静置时间（h）、超声时间（h），应用L9（34）正交进行试验设计，具体试验因素水平与设计如表1与表2所示。

取土牛膝根和根茎粉末（过50目筛）1.0g，精密称定，分别置50ml锥形瓶中，按表2中的因素水平序号进行正交提取，一式两份。表2中的各因素水平具体如表1所示。提取后补足重量，静置，离心，上清液水浴干燥，用甲醇定容至5ml。取样；离心；测定，得到峰面积代入标准曲线的线性方程进行计算，计算出各提取样品中所含的齐墩果酸的含量。

3分析与讨论

通过齐墩果酸对照品HPLC检测的3D图谱可知齐墩果酸的最大吸收峰为210nm；对土牛膝样品的进行检测结果表明：以乙腈：水=61：39为流动相时，土牛膝样品中的齐墩果酸的分离效果较为理想。因此本实验选择流动相为乙腈：水=61：39。笔者还采用超声、静置、加热回流等不同提取方法对土牛膝中的齐墩果酸的提取效果进行比较，结果表明超声的提取和回流提取的效果相当，均优于静置提取的效果，但由于超声提取消耗能量较少，且操作简便，故选用超声做为提取。由表2实验结果可知：极差分析T1＞T3＞T2>T4，表明因素1（即提取溶剂体积）对结果造成的影响最大，其次为因素3（即溶液静置时间）、因素2（即提取溶剂浓度），因素4（即超声时间）对结果的影响最小；正交实验结果的最佳因素水平组合为Ａ3Ｂ2Ｃ1Ｄ1，即本实验的数据表明土牛膝中齐墩果酸的提取条件的最佳工艺为1.0克土牛膝样品用20ml的50%乙醇超声提取30min。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典（Ⅴ部）[S]．北京：化学工业出版社，2015：418．

[2]湖南省食品药品监督管理局.湖南省中药材标准[S].长沙：湖南科学技术出版社，2009：292.

[3]湖南省食品药品监督管理局.湖南省中药饮片炮制规范[M].长沙：湖南科学技术出版社，2010：108

[4]史玉芬，郑延彬.牛膝抗炎、抗菌作用的研究.中药通报，1988，13（7）：44-47．

[5]陆兔林，毛春芹，张丽.牛膝不同炮制品镇痛抗炎作用研究.中药材，1997，20（10）：507-509．

[6]马爱莲，郭焕.怀牛膝抗衰老作用研究.中药材，1998，21（7）：360-362．