紫杉醇长循环脂质体的制备与药动学

紫杉醇长循环脂质体的制备与药动学

曹辉金竹石业娇赵海伟吕雅琪尹莉芳

曹辉金竹石业娇赵海伟吕雅琪尹莉芳(通讯作者)

（中国药科大学药剂教研室江苏南京210009）

【摘要】目的制备紫杉醇长循环脂质体并进行大鼠体内药动学研究。方法用薄膜分散法制备紫杉醇长循环脂质体HPLC法测定血浆中紫杉醇的药物浓度，用药动学计算软件3p97计算药动学参数。结果脂质体平均粒径为（95.9±0.3）nm,平均包封率（97.21±0.22）%脂质体和注射液的AUC/CL分别为752.878/0.0133和387.665/0.0258。结论紫杉醇长循环脂质体显著延长了提高了药物生物利用度和在血液循环系统中的驻留时间,实现了药物的长循环作用。

【关键词】紫杉醇长循环脂质体药动学

【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）10-0069-02

紫杉醇作为一种广谱抗肿瘤药物，FDA批准的适应症包括卵巢癌、乳腺癌及非小细胞肺癌(NSCLC)的一线和二线治疗[1]。

KIibanov等[2]发现用聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）修饰的紫杉醇长循环脂质体，通过减少RES网状内皮系统的识别和摄取，延缓药物的释放速率，使体内循环半衰期增加，延长了药物在体内的血液循环时间。本文制备了紫杉醇长循环脂质体，并考察了体外释放以及其在大鼠体内的药动学行为。

1仪器与材料

1.1材料与试剂

紫杉醇(批号CP-110201，云南汉德生物技术有限公司)，胆固醇(中国慧兴生化试剂有限公司)，大豆磷脂S100PC（790636-09/901,德国LIPOID公司），甲氧基化聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE,美国avantipolarlipids公司），地西泮对照品（中国药品检验所）

甲醇(色谱纯,江苏汉邦科技有限公司)，乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司)，氯仿(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司），磷酸二氢钠(南京化学试剂有限公司），磷酸氢二钠(广东汕头市西陇化工厂），乙醚(国药试剂公司）

1.2动物

SD大鼠180-220g(南京青龙山动物中心)

1.3仪器

旋转蒸发仪RE52CS(上海亚荣生化仪器厂)ZetasizerNanoZS(英国Malvern仪器公司)C18(2)ODS色谱柱(250mm×4.6μm,5μm,南京美欣达科贸有限公司)，SPD-10AVP、LC-10ATVP、COLΜMNHEATERHB-230A(日本岛津公司)

2实验方法

2.1长循环脂质体的制备

薄膜分散法制备长循环脂质体：将大豆磷脂:胆固醇:紫杉醇:mPEG-DSPE按按处方量溶于氯仿与甲醇混合溶液中，37℃减压除去有机溶剂分散成薄膜，真空干燥过夜，磷酸缓冲盐PBS（pH7.4）37℃下水化1h，水化量按药物浓度选择1mg/ml，冰浴探头超声3min(200Hz),挤压通过0.22μm的微孔滤膜，制得紫杉醇长循环脂质体，4℃保存。

2.3脂质体的粒径和包封率测定[3]

脂质体平均粒径采用ZetasizerNanoZS激光粒度测定仪检测。

包封率(％)=包封在脂质体中的药物浓度/制剂中的药物浓度×100%=(C×100-紫杉醇在水合介质中的溶解度)/(C1×100)×100%

2.4HPLC测定血浆中紫杉醇含量的方法建立

2.4.1色谱条件[4]

色谱柱：DimonsilC18(2)(250mm×4.6μm,5μm)；流动相：乙腈-水(体积比54:46)；紫外检测波长：227nm；流速：1ml/min；进样体积：20μl；柱温：30℃。内标：地西泮

2.4.2血浆样品预处理

取待测血浆200μL置于1.5ml离心管中，加入内标溶液地西泮10μL，加入乙醚800μL，涡旋2min，6000r/min离心10min，取乙醚层，于室温下氮气吹干，残渣加入100μL流动相复溶，5000r/min离心5min，取上层清液20μL进样。

2.4.3标准曲线的绘制

取大鼠空白血浆200μL，精密加入不同浓度的紫杉醇对照品溶液以及内标液10μL,使其浓度分别为0.2、0.5、1、2、5、10、200和500μg/ml，按照2.5.2方法操作，HPLC测定记录色谱图，以紫杉醇峰面积与内标峰面积为纵坐标，紫杉醇浓度为横坐标，计算回归方程。

2.4.4回收率与精密度的测定

取大鼠空白血浆200μL,分别加入2、20、200μg/ml高、中、低三个浓度的紫杉醇标准溶液，分别加入10μL内标，各五份，按照2.5.2方法处理，测定回收率与精密度。

2.4.5药动学实验

雄性SD大鼠8只，随机分成两组：一组尾静脉注射紫杉醇注射剂，一组尾静脉注射紫杉醇长循环脂质体，剂量10mg/kg。尾静脉给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、2、4、8和12h于眼眶静脉丛取血0.5ml，置于荡有肝素的离心管内，5000r/min离心10min分离血浆。按照2.5.2方法处理，HPLC测定并记录色谱图，根据标准曲线计算血药浓度。

2.4.6数据处理

用药动学处理软件3p97计算紫杉醇长循环脂质体以及紫杉醇注射剂的药物动力学参数包括：血浆药物峰浓度（Cmax）、血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、血浆清除率（CL）、表观分布容积（Vd）、分布相半衰期（t1/2α、t1/2β）、消除半衰期（t1/2γ）等。

3结果

3.1脂质体的粒径和包封率

脂质体粒径分布测定结果显示其粒径分布成正态分布。脂质体平均粒径为（95.9±0.3）nm,多分散系数为0.222，平均包封率（97.21±0.22）%。

3.2HPLC测定血浆中紫杉醇含量的方法建立

3.2.1标准曲线的制备

以紫杉醇与内标峰面积之比（f）为纵坐标，血药浓度(C)为横坐标，线性回归方程为f=0.002C-0.008，r=0.999，在1～1000μg?mL-1的浓度范围内线性关系良好。

3.2.2绝对回收率和相对回收率

高、中、低浓度血浆样品的绝对回收率均大于90%，根据文献，当该值≥70%时即认为绝对回收率较好；同时高、中、低浓度血浆样品的相对回收率在97-103%之间，文献中一般要求相对回收率在85-115%范围内即可，故该方法的相对回收率符合生物样品分析的要求。

3.2.3日内精密度和日间精密度

高、中、低浓度血浆样品日内和日间精密度测定值的RSD均不大于15%，符合生物样品分析的要求。

3.3药动学数据

3.3.1血药浓度-时间曲线

自制紫杉醇长循环脂质体和市售紫杉醇注射剂经大鼠尾静脉注射后，血药浓度-时间曲线见图1

图1紫杉醇长循环脂质体在大鼠血浆中的血药浓度经-时曲线

Fig1Meanplasmaconcentrationofpaclitaxelinratsafterivadministrationofpaclitaxelinjectionsandpaclitaxelliposomeatasingledoesof10mg?L-1

3.3.2主要药动学参数

上述血药浓度-时间曲线数据用3p97程序拟合，符合二室模型，用房室模型分析得到的紫杉醇脂质体和紫杉醇注射液的药物动力学参数包括：血药峰浓度（Cmax）、血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、血浆清除率（CL）、表观分布容积（Vd）、分布相半衰期（t1/2α，t1/2β），消除相半衰期（t1/2γ）等，见表4。

表1紫杉醇长循环脂质体和注射液大鼠尾静脉给药后的药动学参数

4讨论

体内药动学结果表明，将紫杉醇包载于PEG修饰的长循环脂质体中，与其游离药物注射剂相比可明显延长药物的体内循环的时间，AUC高于游离药物，实现了药物的体内长循环作用，有利于在体内进一步发挥药效作用，同时降低毒性与不良反应，提高疗效，将会成为临床肿瘤治疗的新策略[5]。

参考文献

[1]Weiss,RB,DonehowerRC,WiernikPH,etal.Hypersensitivityreactionsfromtaxol.JClinOncol.1990,8(7):1263-8.

[2]NuhadK.Ibrahim,NeilDesai,SewaLegha,etal.PhaseIandpharmacokineticstudyofABI-007,aCremophor-free,protein-stabilized,nanoparticleformulationofpaclitaxel.ClinCancerRes.2002,8(5):1038-44.

[3]KlibanovAL,MaruyamaK,BeckerlegAM,etal.Activityofamphipathicpoly(ethyleneglycol)5000toprolongthecirculationtimeofliposomesdependsontheliposomesizeandisunfavorableforimmunoliposomebindingtotarget[J].BiochimBiophysActa,1991,1062(2):142-148.

[4]杨瑞，梅丹宇，杨媛，等.紫杉醇长循环肝靶向脂质体的制备.军事医学科学院院刊.2008,32(4):359-61.

[5]赵慧，王坚成，罗春蕾,等.多肽GRGDS修饰的紫杉醇长循环靶向脂质体的体外评价.中国新药杂志.2008,17(23):2034-8.

该项目获2011年中央高校专项业务费专项资金支持,项目号为02410535