健脾益气通络中药复方对早期糖尿病大鼠肾组织podocin基因表达的影响

健脾益气通络中药复方对早期糖尿病大鼠肾组织podocin基因表达的影响

李琼锋王亚韦衮政李黔云

（云南省中医医院；云南昆明650021）

【摘要】目的：将健脾益气通络中药复方应用于早期糖尿病肾病大鼠模型中，分析其对肾组织podocin基因表达的影响及肾脏超微结构的影响。方法选取60只健康雄性SD大鼠，将大鼠依据随机法分成6组：肾切组、模型组、洛汀新组、中药低、中、高剂量组，各组给予相应药物剂量灌胃6周，于第6周末检测各组大鼠24h尿蛋白（Upro）定量、肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）；取肾脏行HE染色以及透射电镜观察肾皮质组织病理改变；RT-PCR法测肾皮质podocin表达水平。结果：模型组大鼠与肾切组大鼠相比，光镜及电镜下已出现糖尿病肾病病理改变，各治疗组肾皮质病理病变较轻。洛汀新组、中药低、中、高剂量组与模型组比较，Upro量显著下降（p＜0.01）；各治疗组与模型组比较，肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）明显降低（p＜0.05）；洛汀新组及中药低、中、高剂量组与模型组比较podocinmRNA表达水平显著上调（p＜0.05）。结论健脾益气通络中药对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病大鼠的肾脏有一定的保护作用。

【关键词】健脾益气通络中药；糖尿病肾病；大鼠；超微结构；podocin

糖尿病肾病（DN）为糖尿病性微血管病变所引起，病理诊断名称为糖尿病性肾小球硬化症，是糖尿病（DM）严重并发症之一，是糖尿病患者死亡的主要原因。对糖尿病肾病开展健脾、益气及通络治疗，临床取得了较好效果。本文主要研究将健脾益气通络中药应用于糖尿病肾病大鼠模型中对其肾组织podocin基因表达的影响作用及肾脏超微结构的影响作用。

1.材料

1.1动物

选取60只健康雄性SD大鼠，均为SPF级，体重为200到250g，购自昆明楚商科技有限公司。将大鼠依据随机法分成6组：肾切组、模型组、洛汀新组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。

1.2药物与试剂

健脾益气通络中药复方用免煎中药配方颗粒(江阴天江药业有限公司生产)，由党参20g、白术20g、黄芪30g、茯苓20g、泽兰20g、丹参20g、水蛭6g组成。西药选用洛汀新（盐酸苯那普利片，10mg/片，北京诺华制药有限公司制造）。链脲佐菌素（STZ），（由美国Sigma公司提供）。Trizol试剂(由美国Invitrogen公司提供)。逆转录试剂盒、Taq酶、dNTP(由加拿大MBIFermentas公司提供)。大鼠podocin引物（由上海捷瑞生物工程有限公司提供）。

1.3仪器

代谢笼(由北京翼诺泰科技发展有限公司提供)；血糖仪及试纸（由德国罗氏诊断公司提供)；全自动生化分析仪(由美国贝克曼公司提供)；电子天平(由北京赛多利斯电子天平有限公司)；PCＲ循环仪(由英国horhnoHybaid公司提供)；电脑三恒电泳仪提供(由北京六一仪器厂提供)；光学显微镜(由日本OLYMPUS公司提供)；超低温冰箱(由日本三洋公司提供)。

2.方法

2.1动物模型

雄性SD大鼠60只，普通饲料适应性喂养1周，分别测定尿蛋白阴性后行左肾切除术。2周后随机抽取10只为单纯肾切组，剩余50只大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）40mg/kg，72小时后尾静脉取血测血糖，血糖≥16.7mmol/L为DM造模成功。

2.2动物分组及给药方法

将造模成模大鼠随机分为5组。西药对照组大鼠给予西药洛汀新0.9mg（kg.d）灌胃，中药低、中、高剂量组分别给予免煎中药配方颗粒5.29mg、10.58mg、21.16mg（kg.d）灌胃，肾切组及模型组分别给予同等生理盐水灌胃，每日1次，给药疗程共6周。大鼠自由进食、饮水，室温18℃-20℃，相对湿度，12小时交替照明。实验期间每天测量1次尾静脉血糖，对血糖≥26mmol/L的大鼠，可能危及生命，给予适量长效胰岛素（1-4ｕ）皮下注射，使血糖维持在16.7mmol/L以上，避免发生酮症，减少大鼠死亡。

2.3检测指标

2.3.1取材：于第6周末，将大鼠置入代谢笼内，收集24h尿液，记录总量，检测各组大鼠24小时尿蛋白量（Upro）(云南中医学院附属医院检验科检测)。实验结束时，所有动物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，用于检测血清肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）水平(云南中医学院附属医院检验科检测)，分离肾脏，取右肾上极皮质，置于4℃预冷的4％戊二醛电镜固定液中，切成1mm3小块，用玻璃吸管移至标本瓶内，留做电镜观察，其余肾皮质一部分置于10%的中性甲醛固定留做常规病理学观察，剩余肾皮质液氮速冻后放于-70℃冰箱，用于RT-PCR检测。

2.3.2反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肾皮质podocin的表达：采用Trizol法提取RNA，反转录试剂盒反转录cDNA。引物序列：Podocin上游引物：5＇GGCACTCCACCAGCTAGG-GACTTC-3＇。下游引物：5＇-AGTTCCCACTCCACCAG-CTTCTTC-3＇。β-actin上游引物：5＇-TCCACCACCC-TGTTGCTGTA-3＇。下游引物：5＇-ACCACAGTCCAT-GCCA-TCAC-3＇。Podocin和β-actin的PCR扩增产物大小分别为200bp、452bp。PCR反应条件：94度预变性5分钟，94度变性50秒，退火温度50秒，72度延伸1min，共32个循环；72度在延伸7分钟。取PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶图像分析系统测定灰度值，以β-actin基因表达量为内参照物，以目的产物与β-actin的灰度比值表示mRNA相对含量。

2.4统计方法

数据采用统计软件（SPSS21.0版本）进行分析统计。计量资料采用均数±标准差（?x±s）的形式，组间差异采用ANOVA单因素方差分析，使用LSD法进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1一般情况

单纯肾切组大鼠精神状态良好，饮食正常，动作敏捷，反应灵敏，毛色光泽，肌肉丰满，尿量正常。其余组注射链脲佐菌素后，均表现为多饮、多食、多尿，精神萎靡，动作迟缓，反应迟钝，少动抱团，毛枯黄稀少，部分大鼠出现感染、溃疡等并发症。治疗期间各组都有大鼠死亡情况，其中中药低剂量、高剂量组各死亡3只，中剂量、洛汀新组各死亡2只，模型组死亡4只。

3.2各组大鼠24h尿蛋白定量的比较

与单纯肾切组比较，模型组大鼠Pure含量显著升高（p<0.01），各治疗组Pure含量均升高（p<0.05）。与模型组比较，经药物干预后各组大鼠的UPro含量显著降低（p<0.01）。洛汀新组及中药低、中、高剂量组之间无统计学意义（p>0.05）

3.3各组大鼠肾功能的比较

与单纯肾切组比较，模型组Scr、BUN值均明显升高（p<0.01），各治疗组Scr值无显著差异（p>0.05），BUN值升高明显（p<0.01）；与模型组比较，各治疗组Scr值下降（p<0.05），中药中、高剂量组BUN值下降（p<0.05），结果见表1。

3.5肾脏病理学

光镜观察显示：单纯肾切组大鼠肾皮质中肾小球结构清晰，体积正常，未见增大及萎缩，肾小球囊腔光滑无渗出，基底膜无增厚，细胞外基质与系膜细胞分布正常，肾小管结构清晰无管型；模型组大鼠肾脏肾小球肥大、充血、肿胀，球囊间隙变窄，肾小球毛细血管基底膜增厚，肾小球系膜区基质增多、系膜细胞增生，系膜区增宽，部分肾小管上皮细胞空泡变性。中药组和洛汀新组病理改变均明显轻于模型组。电镜观察显示：单纯肾切组大鼠肾小球基底膜均匀无增厚，上皮足突细长整齐，分布均匀；模型组大鼠肾脏肾小球基底膜弥漫性均匀增厚，系膜区扩大，系膜区基质明显增多，足突融合。中药组和洛汀新组明显轻于模型组。

4.讨论

蛋白尿不仅是早期诊断糖尿病肾病的一个重要指标，而且也是导致肾脏病变进行性发展的重要危险因素[1]。目前已经形成共识，即尿蛋白（UPro）的发生与肾小球滤过屏障异常有密切关系。肾小球滤过屏障包括三层：内皮细胞窗孔、肾小球基底膜(GBM)以及位于脏层上皮细胞足突之间的裂孔隔膜。而裂孔隔膜是滤过屏障中最主要的部位，可以阻止绝大部分蛋白质漏出到原尿中，故与蛋白尿的发生密切相关［2］。近年来已经先后确定了多个由足细胞表达、对维持正常裂孔隔膜功能十分重要的分子成分。其中Podocin是2000年Boute等通过定位克隆技术研究发现的新发夹样结构的整合膜蛋白，由NPHS2基因编码，以寡聚体的形式特异性地表达于足细胞裂孔隔膜处［3］。Podocin是足细胞裂孔隔膜上一种重要的结构蛋白，具有多种生物活性功能，它的正常表达及分布对维持滤过膜完整的形态结构和屏障功能有着重要意义。若发生异常可导致大量蛋白尿的产生［4］。因此观察足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin变化在糖尿病肾病蛋白尿的发生和发展至关重要。

中医学中糖尿病肾病（DN）可依据不同的临床症状，归属中医“肾消”、“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“关格”等病证范畴。目前中医治疗DN，“多从肾论治”。笔者认为脾为后天之本，气血生化之源，有升清、固摄和散精的作用。正如《素问．经脉别论篇》曰:“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通条水道，下输膀胱，水精四布，五经并行”。糖尿病的主要诊断依据是血糖升高超过标准，而血糖乃饮食所化之的水谷精微，若脾失健运之职，血中之糖（水谷精微），就不能输布于脏腑而营养四肢百骸，导致血糖蓄积。胰岛素相对或绝对不足，相对于中医为脾气虚弱，运化水谷精微功能不足，脾“为胃行其津液”的物质基础匮乏和功能失调，故病机关键在于脾虚[5]。脾虚则固摄无力导致精微物质即蛋白质流失，出现蛋白尿。“脾虚”，气血生化乏源，气虚则鼓动无力，血运迟滞，脉络瘀阻；血虚则脉络充盈欠佳，血行缓慢，血液中致病物质沉积于脉络，致脉络狭窄，二者均可导致瘀血而成瘀证。“消渴”病若控制不佳，随着病情发展波及于肾，肾气亏虚，肾失封藏，加重精微物质持续下注，加重蛋白尿的流失。因此，在糖尿病肾病的发生发展过程中，总以“脾虚”、“脾伤”为始动环节，糖尿病肾病早期以脾气虚弱，瘀血阻络为基本病机，日久脾病传肾。故本实验采用健脾益气通络中药复方来进行干预，并取得了良好的效果。

本实验结果表明模型组大鼠与肾切组大鼠相比，光镜及电镜下已出现糖尿病肾病病理改变，各治疗组肾皮质病理病变较轻。中药低、中、高剂量组可显著减少糖尿病肾病大鼠尿蛋白，各治疗组均能降低肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）水平，与洛汀新组降尿蛋白作用相当，改善肾功能稍好，需进一步研究二者的协同效应。本实验展示健脾益气通络中药复方应用于早期糖尿病肾病大鼠模型中，可促使大鼠肾组织podocin基因表达明显增加，使肾小球滤过膜的完整性得到一定程度的恢复，蛋白尿排除减少。

参考文献：

[1]张江华，陈志强，赵雯红等.益气养阴消癓中药对早期糖尿病肾病大鼠24h尿蛋白及nephrin、prodocin基因表达的相关性分析（J）.北京中医药大学学报，2013（10）：671-675

[2]PavenstadtH，KrizW，KretzlerM.Cellbiologyoftheglomerularpodocyte〔J〕.PhysiolＲev，2003，83(1):253-307.

[3]BouteN.NPHS2，encodingtheglomerularproteinpodocin，ismutatedinautosomalrecessivesteroid-resistantnephroticsyndrome〔J〕.NatGenet，2000，24(4):349-54.

[4]DALLAVESTRAM.MASIEROA.ROITERAM,etal.Ispodocyteinjuryrelevantindiabeticnephropathy?Studiesinpatientswithtype2diabetes〔J〕.Diabetes，2003，5（4）:1031-1035

[5]李琼锋,韦衮政，李黔云，张军等.健脾益气通络方对早期糖尿病肾病大鼠血清脂联素与血清超敏C－反应蛋白影响的实验研究〔J〕.云南中医中药杂志，2016，8（8）:78-80

基金项目：云南省科技厅-云南中医学院应用基础联合专项资金项目[项目编号：2015FB205（-033）]；云南省医疗卫生单位内设研究机构科研项目（项目编号：2016NS174）

作者简介：李琼锋（1966—），主任医师，研究方向：内分泌病的研究