重组hIL-10酵母表达载体的构建及鉴定

重组hIL-10酵母表达载体的构建及鉴定

陈富超孙万邦杜联峰黄俊琼罗军敏宋明

陈富超孙万邦杜联峰黄俊琼罗军敏宋明英遵义医学院563003

封建凯烟台市玉皇顶医院264000

摘要目的：构建hIL-10基因的酵母表达载体，为hIL-10在毕赤酵母高效表达和生物学功能研究奠定基础。方法：采用PCR从质粒pORF5-hIL-10中扩增hIL-10基因，以内切酶EcoRI/XbaI对hIL-10基因和质粒pPICZαA进行酶切，将酶切产物进行连接，纯化连接产物并电转化E.coliDH5α，用含Zeocin的LB培养基筛选重组大肠杆菌并抽提质粒进行酶切和DNA测序鉴定；以重组质粒电转化感受态毕赤酵母，以不同浓度Zeocin的YPDS平板筛选重组酵母菌株并对重组酵母作菌落PCR鉴定。结果：经PCR从质粒pORF5-hIL-10中扩增获得大小约540bp的片段；重组质粒经EcoRI/XbaI酶切后获得约540bp和3500bp的两种片段；DNA测序结果与Genbank中hIL-10基因序列一致；重组酵母经菌落PCR也获得540bp的片段。结论：成功构建了hIL-10基因的酵母表达载体pPICZαA-hIL-10。

关键词表达白细胞介素-10菌落PCR毕赤酵母电转化

白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是Fiorentino等最早发现的一种广泛存在于人和动物体内、具有多向调节功能的细胞因子。人白细胞介素-10（humanIL-10，hIL-10）基因定位于人的一号染色体，编码178个氨基酸的多肽，其中包括18个氨基酸的信号肽。IL-10具有有免疫抑制作用，抑制单核细胞依赖性Th细胞增生并抑制Th1类细胞因子的合成及其活性；抑制单核细胞表面MHCⅡ类分子表达，降低单核细胞提呈抗原能力，阻断抗原特异性单核-巨噬细胞因子的产生；参与T细胞免疫反应的调节，抑制T细胞的激活，诱导T细胞的免疫耐受；IL-10同时也具有免疫增殖作用，促进B细胞的活化、增殖、分化和抗体分泌。IL-10是重要的抗炎细胞因子，对促炎细胞因子有广泛的抑制作用，在多种疾病中起保护作用。hIL-10的活性形式是二聚体，非常适合于真核表达。目前临床研究用的产品为大肠杆菌表达的重组蛋白，商品名Tennovil，内毒素含量为0.003内毒素单位·µg-1，I期和II期临床试验涉及到其安全性、耐受性、药物动力学、药代动力学、免疫性研究还不够深入，价格还比较昂贵，研发新的IL-10产品仍有较大实用价值。本研究采用基因重组技术，构建hIL-10基因的酵母表达载体pPICZαA-hIL-10，为进一步探索hIL-10在酵母X-33表达的条件，开发产量高、生产成本低、纯化效率稳定、具有广泛用途的IL-10生物制品奠定基础。

1．材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株质粒pORF-hIL-10购自InvivoGen公司；质粒pPICZαA和酵母菌株X-33、购自美国Invitrogen公司；大肠杆菌E.coliDH5α，为遵义医学院疫学教研室提供。

1.1.2主要试剂高保真即用PCR试剂盒、一步法制备感受态细胞溶液SSCS、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒等购自Fementas公司；限制性内切酶、T4连接酶、DNAMarker购自Takara;抗生素Zeocin.TM购自美国Invitrogen公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1引物设计及hIL-10基因PCR扩增根据hIL-10基因全长和质粒pPICZαA中的多

克隆位点，用软件PimerPremier设计引物，由Takara公司合成一对引物，

上游引物：5’CGGAATTCATGGCCCACAGCTCAGCA3’，

下游引物：5’GCTCTAGACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3’。

其中斜体划线部分为引入的EcoRI位点XbaI位点。以质粒pORF-hIL-10为模板经PCR扩增hIL-10，PCR反应条件为：50μl反应体系中，94℃，预变性10min，94℃变性45s，52℃，退火45s，72℃，延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。PCR结束后以1.0%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

1.2.2重组质粒pPICZαA-hIL-10构建使用EcoRI/XbaI对纯化后的hIL-10基因及质粒pPICZaA进行双酶切。用凝胶回收试剂盒分别回收目的片段，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳。并以T4连接酶连接两种目的片段，将连接产物转化感受态E.coliDH5α，再将经过转化的感受态E.coliDH5α涂布于含25μg/μlZeocin的LB平板，待重组菌落形成后，挑取单个菌落培养，抽提质粒作琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3重组质粒pPICZαA-hIL-10酶切鉴定和测序鉴定以EcoRI/XbaI对所提质粒做双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳观察。并送一份抽提质粒到Takara公司进行测序。

1.2.4重组酵母的筛选及菌落PCR鉴定以重组质粒pPICZαA-hIL-10电转化感受态毕赤酵母X-33并作质粒pPICZαA转化的对照。将经过电转化的X-33涂布于含不同浓度Zeocin的YPD平板，30℃培养3d，挑取以质粒pPICZαA电转化形成的重组酵母菌落1个及以质粒pPICZαA-hIL-10电转化形成的重组酵母菌落12个，以溶细胞酶消化后为模板进行PCR，扩增整合到酵母染色体上的目的基因。

2．结果

2.1hIL-10基因PCR扩增以质粒pORF5-hIL-10为模板，用Takara公司合成的一对特异引物进行PCR，扩增hIL-10基因，琼脂糖凝胶电泳显示经PCR扩增到的的目的基因片段大小为550左右（见图1），与预期大小一致。

2.2重组质粒pPICZαA-hIL-10的构建及鉴定hIL-10基因及质粒pPICZαA经EcoRI和XbaI酶切后，以酶切产物分别进行1.2%和1.0%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，hIL-10基因的酶切产物呈单一条带，相对分子量大小约540bp（见图2）；pPICZαA质粒的酶切物相对分子量大在3500bp左右，也为单一条带（见图3）。两种酶切产物的连接产物电转化E.coliDH5α后，抽提重组质粒在1.2%琼脂糖凝胶电泳后显示为4100bp左右的条带（见图4）。重组质粒经EcoRI/XbaI酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示为同一泳道上3500bp左右和540bp左右的两种片段（见图5）；重组质粒经DNA测序，结果显示与Genbank中报道的hIL-10基因序列一致（见图6），无碱基突变，且密码子读框正确。

图1:hIL-10基因PCR扩增

Fig1:AmplificationofhIL-10genebyPCR

M:DNAMarkerDL2,00

Lane1:productofplasmidpORF5-hIL-10AmplifiedbyPCR

图2:hIL-10基因的酶切结果

图3:质粒pPICZαA经EcoRI/XbaI酶切结果

Fig2:ResultofhIL-10digestedFig3:ResultofplasmidpPICZαAdigested

byEcoRI/XbaIenzymebyEcoRI/XbaIenzyme

M:λ-HindⅢDNAMarkerM:λ-HindⅢDNAMarker

1:hIL-10genedigestedbyEcoRI/XbaI1:plasmidpPICZαAdigestedbyEcoRI/XbaIenzymeenzyme

图4:重组质粒pPICZαA-hIL-10的构建结果

图5:质粒pPICZαA-hIL-10酶切鉴定

Fig4:resultofconstructiongofrecombinantFig5:plasmidpPICZαA-hIL-10

plasmidpPICZαA-hIL-10identificatedbydigestion

M:λ-HindⅢDNAMarkerM1:λ-HindⅢDNAMarker

1:recombinantplasmidpPICZαA-hIL-10M2:DNAMarkerDL2，000

1:productofPICZαA-hIL-10afterdigestion

图7:重组酵母菌株的菌落PCR结果

图6:质粒pPICZαA-hIL-10DNA测序结果

Fig6:sequencingresultofplasmidpPICZαA-hIL-10

2.3重组酵母菌株的筛选及菌落PCR鉴定重组质粒pPICZαA-hIL-10电转化感受态毕赤酵母X-33后，经不同浓度Zeocin的YPDS平板筛选，Zeocin浓度为100μg/ml时，YPDS平板上形成菌菌落几乎长满整个平板；Zeocin浓度增加到1000μg/ml，每个平板只筛选到了近20个菌落。以1000μg/mlZeocin浓度的YPDS平板筛选到的重组菌落为模板进行PCR，每个重组菌落均扩增出与目的基因同等大小的条带（见图7）。

3．讨论

目前IL-10的研究已经远远超出了生物学范围，临床试验研究显示了IL-10在炎症性疾病[4]、自身免疫病、器官移植[6]等方面有广泛的应用前景，但IL-10的现有产品在活性、产量以及价格等方面仍有待改善。目前国内外为临床试验和基础研究提供的IL-10产品，多数是利用原核生物大肠杆菌表达的重组IL-10，活性不稳定，副作用较多。真核表达方面，IL-10在昆虫、植物细胞和哺乳动物细胞表达系统中的表达量都很低，远不能满足临床治疗和基础研究工作的需要。用毕赤酵母表达其他细胞因子却有很成功的先例。如何以较低的成本稳定地获得有良好生物学活性的IL-10已成为亟需解决的科研问题。产量高、毒副作用少、表达水平高而且产物活性稳定是当前医药生物研发的要求，基于对这些因素的综合考虑，本研究采用毕赤酵母X-33表达hIL-10，并选用适合酵母表达的pPICZα系列表达载体构建了hIL-10的真核表达载体。

pPICZα系列表达载体包括pPICZαA、pPICZαB和pPICZαC3种分泌型的表达载体，适合分子量为30～50kD的外源蛋白的表达。hIL-10的分子量在35～40kD，适合该系列表达载体对外源蛋白分子量的要求。根据3种分泌型的表达载体的多克隆位点和所用工具酶的特点，我们选择了pPICZαA作为表达载体。质粒pPICZαA是毕赤巴斯德酵母表达系统的一种常用的分泌型表达质粒，其信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子（α-factor）。该表达质粒具有如下特点：（1）具有强效可调控启动子AOX1（alcoholoxidase，醇氧化酶）；（2）具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDS平板上生长的转化子中，100%都有外源基因的整合，大大简化了重组酵母的筛选过程，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZαA的大肠杆菌转化子，不必另外使用氨苄青霉素，经济而又简便；（3）在表达载体A0X15’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X13’端终止序列；（4）分泌效率强的信号肽α-factor，能较好地指导外源蛋白的分泌。由于hIL-10的分子量在35～40kD，适合pPICZαA表达载体对外源蛋白分子量的要求。

毕赤酵母对外源蛋白的信号序列识别能力差，往往需要利用表达载体上携带的具有高分泌效率的信号肽，而选用pPICZαA表达载体的目的之一是要实现分泌表达。本研究在设计引物的时候去除了hIL-10基因中编码信号肽的碱基，利用pPICZαA所带α信号肽指导分泌表达。由于使用酿酒酵母的α-因子在毕赤酵母分泌表达外源蛋白时，大多数蛋白N-端含有4个多余的氨基酸残基，是由于毕赤酵母的信号肽酶STE13不能将N-端氨基酸残基EAEA切去，认为是该酶的切割效率不高，或者是STE13酶表达率低，也或是N-端的EA重复二肽因为有其他氨基酸残基影响不能有效与STE13信号肽酶结合。多余的N-端氨基酸残基常常会改变所表达蛋白(特别是药物类蛋白)的部分功能，因此，本研究在设计IL-10基因与α因子前导肽基因融合时，直接将hIL-10蛋白的N-端连在毕赤酵母的信号肽酶KEX2切割的氨基酸残基之后，避免了rhIL-10的N-端出现多余的氨基酸残基，这在一定程度上可保证rhIL-10的正常结构和生物学功能，也为rhIL-10能应用于基础和临床研究提供了保障。同时，引物设计中去掉了hIL-10基因所带的终止密码子，而利用了质粒pPICZαA上的终止密码子，这样就在构建的表达载体中引进了原癌基因位点和多聚组氨酸编码基因两种分子标签，这样在后继研究实验中就可以利用分子标签对所表达产物rhIL-10进行鉴定和纯化，从而为蛋白分离和纯化带来很大的便利。

根据酵母启动子与外源基因之间的距离越短对目的基因的表达越有利的原理，同时兼顾工具酶的常用性和可获得性，本研究表达载体pPICZαA的多克隆酶切位点中选择了EcoRI和XbaI两种酶的作用位点作为亚克隆的位点，并在引物设计和合成时引入了这两个位点。质粒pORF5-hIL-10的hIL-10基因段及两端附近没有EcoRI和XbaI作用位点，因此可用作PCR模板。按照这样的设计，通过PCR我们顺利获得了两端分别带有EcoRI和XbaI作用位点的hIL-10基因，并经过酶切和连接反应获得了重组质粒。重组质粒酶切前后比较，酶切前的位置要偏向分子量小的一端，看起来似乎比酶切后的分子量还小，这是因为环形质粒在电泳时的迁移速率比线性化质粒大造成的结果，同样的现象在质粒pPICZαA中也存在。重组质粒pPICZαA-hIL-10酶切后产生的小片段与目的基因酶切产物的电泳结果很一致，表明目的基因已按预期的设计插入到所选择质粒的多克隆位点。测序结果经读图软件分析及BLAST比对，与质粒pORF-hIL-10中的hIL-10基因序列完全相同，并与Genbank中hIL-10基因序列一致,没有碱基突变和移码，说明构建工作完全按预期完成。本实验构建的重组质粒是一种穿梭质粒，既可在细菌中存在，也能在酵母中存在。所以hIL-10基因是否已经整合到毕赤酵母，还需转化毕赤酵母并作菌落PCR鉴定。电转化后重组酵母菌落PCR与hIL-10基因扩增所用引物及反应条件完全一样，扩增的的片段大小也一致，证实重组质粒pPICZαA-hIL-10能够正常转化毕赤酵母。酶切鉴定、DNA测序、酵母菌落PCR的结果获得了互相吻合的结果，说明重组质粒构建完全成功，可以用于下一步的表达研究。

参考文献

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注：本课题受贵州省教育厅自然科学基金重点培育项目黔教科2008032和贵州省科技厅基金[2009]2176资助