20株泛耐药鲍曼不动杆菌耐药相关基因的样本聚类分析

20株泛耐药鲍曼不动杆菌耐药相关基因的样本聚类分析

凌月明1陈金玉1蔡媛媛1兰小鹏2

1.福建泉州解放军第180医院福建泉州362000；

2.南京军区福州总医院全军临床检验医学研究所福州350025

【摘要】目的：调查泛耐药鲍曼不动杆菌菌株间的亲缘关系。方法；收集2010年7月至12月本院住院患者痰标本中分离的泛耐药鲍曼不动杆菌20株，用gyrA和parC基因的分子鉴定法鉴定菌种，采用聚合酶链反应（PCR）的方法分析3种耐药相关的看家基因(carO、gyrA、parC)和57种水平转移获得与β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因以及13种接合性质粒、整合子、转座子(含插入序列)等可移动遗传元件遗传标记，对检测结果作样本聚类分析。结果；20株泛耐药鲍曼不动杆菌共检出3种与耐药相关的看家基因，5种获得性β-内酰胺类耐药基因(TEM-1、PER、ADC-30/65/66、OXA-23、OXA-66),5种获得性氨基糖苷类耐药基因(aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、armA),2种抗菌制剂外排泵基因(adeB、qacE△1)，5种可移动遗传元件的遗传标记(intⅠ1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba1)。样本聚类分析提示，1号株～16号株为同一克隆,17号株～19号株亦为同一克隆。结论；本组20株泛耐药鲍曼不动杆菌表型相同，但耐药基因的样本聚类分析显示出3个簇群，其中二个为同一克隆的播散。

【关键词】鲍曼不动杆菌；β-内酰胺类；氨基糖苷类；喹诺酮类；可移动遗传元件；样本聚类分析；泛耐药

【中图分类号】R440【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）9-0994-02

Sampleclusteranalysisofresistancegenesin20strainsofpandrug-resistantAcinetobacterbaumannii

LingYue-Ming1,Chenjin-yu1,Caiyuan-yuan1,LanXiao-peng2

(1The180HospitalofPLA,Quanzhou362000;

2PLAInstituteLaboratoryMedicine,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou350025)

【Abstract】Objective：Toinvestigatethephylogeneticanalysisamongagroupofpandrug-resistantAcinetobacterbaumannii(A.Baumannii).Methods：FromJuly2010toDecember,20strainsofpandrug-resistantA.baumanniiwerecollectedfromahospitalinChina.MolecularidentificationwereusedbygyrAandparCtoidentifyspecies，then,resistancegeneswereanalyzedbyPCR,including3kindsofhousekeepinggenes（carO,gyrA,parC）and57kindsofresistancegenesacquiredbyhorizontaltransfertobeta-lactams,aminoglycosides,quinolones,aswellas13kindsofgeneticmarkersofconjugalplasmids,transposons,insertionsequences,andintegrons.Inaddition,sampleclusteranalysiswereperformed.Results：In20strainsofpandrug-resistantA.baumannii,3kindsofhousekeepinggenes,5kindsofacquiredbeta-lactam-resistancegenes(TEM-1,PER,ADC-30/65/66,OXA-23,OXA-66),5kindsofacquiredaminoglycoside-resistancegenes(aac(3)-Ⅰ,aac(6’)-Ⅰb,ant(3”)-Ⅰ,aph(3’)-Ⅰ,armA),2kindsofdrugeffluxgenes(adeB,qacE△1),5kindsofgeneticmarkersofmobilegeneticelements(intⅠ1,tnpU,tnp513,IS26,ISaba1)werepositive.AndsampleclusteranalysisshowedthatStrainNo.1-StrainNo.16wasthesameclone,StrainNo.17-StrainNo.19wasalsothesameclone.Conclusion：phenotypesof20strainsofpandrug-resistantA.baumanniiwerethesame,butsampleclusteranalysisofresistantgenesshowedthatthesestrainswerepidedinto3clusters,and2clusterswereclonaltransmission.

【Keywords】Acinetobacterbaumannii;Beta-lactams;Aminoglycosides;Quinolones；Mobilegeneticelement;Sampleclusteranalysis;Pandrug-resistance

国内已有基于看家基因和水平转移基因的检测结果作样本聚类分析,对多耐药鲍曼不动杆菌和耐药大肠埃希菌进行亲缘性分析[1,2]。为探讨泛耐药鲍曼不动杆菌(Pandrug-ResistantAcinetobacterbaumannii,PDR-ABA)的抗菌药物作用靶位编码基因突变状况(突变耐药机制)和获得耐药基因存在状况(获得性耐药机制)以及菌株间的亲缘关系,我们对一组(20株)PDR-ABA菌进行了3种与耐药相关的看家基因，即喹诺酮作用靶位编码基因(gyrA、parC)、碳青霉烯类膜孔通道蛋白编码基因(carO)突变分析和57种水平转移获得与β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因以及13种接合性质粒、整合子、转座子(含插入序列)等可移动遗传元件遗传标记检测,并对测得结果进行样本聚类分析,现报告如下。

1材料与方法

1.1菌株收集、菌种鉴定及药敏试验20株PDR-ABA菌均分离自2010年7月至12月解放军第180医院患者之痰液标本。采用gyrA和parC基因测序分子鉴定法鉴定菌种。药敏试验为K-B纸片法,抗菌药物敏感性判断根据美国CLSI2010年版进行。药敏检测结果为:哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美洛培南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲恶唑13种抗菌药物均耐药,与FalagasME等报道一致[3]。

1.2模板制备蛋白酶K消化法。

1.3基因检测PCR试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供，全部PCR引物由无锡新区虎马生物信息学工作室设计并获授权使用。

1.4聚类分析检测结果作样本聚类分析(UPGMA法)。

2结果

检测结果见表1。PDR-ABA菌检测结果的样本聚类分析见图1。

图120株PDR-ABA菌检测结果的样本聚类分析

Fig1Sampleclusteranalysisof20strainsofpandrug-resistantAcinetobacterbaumannii

3讨论

细菌的抗菌药物作用靶位编码基因(含药物膜孔通道蛋白编码基因)突变耐药与细菌借助于整合子、转座子(含插入序列)和质粒等可移动遗传元件获得耐药基因是细菌主要的耐药机制。前者主要为垂直传播(即只能亲代细胞传给子代细胞)；而后者既能垂直传播,又可水平播散。因此,可移动遗传元件介导的获得性耐药基因危害更大。细菌转座子(含插入序列)可携带β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、16SrRNA甲基化酶基因、喹诺酮作用靶位保护蛋白基因、外排泵基因[4,5]。与转座子相邻的耐药基因可出现高表达现象,转座子介导的获得性耐药基因还与耐药程度相关联。

β-内酰胺类药物耐药相关基因中A类β-内酰胺酶基因检出TEM-1和PER,C类β-内酰胺酶基因检出ADC,D类β-内酰胺酶基因检出OXA-23和OXA-66。其中TEM-1、ADC、OXA-23、OXA-66检出均达100%。20株PDR-ABA菌carO基因均存在有义突变。氨基糖苷类药物耐药相关基因检出aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ等4种氨基糖苷类修饰酶基因和armA16SrRNA甲基化酶基因。其中ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ检出均达100%。喹诺酮类药物耐药相关基因检出喹诺酮作用靶位编码基因gyrA、parC有义突变。喹诺酮作用靶位保护蛋白基因qnrA、qnrB、qnrS,喹诺酮外排泵基因qepA均未检出。adeB、qacE△1检出也达100%。adeB基因为AdeABC外排泵中泵蛋白AdeB的编码基因。基因组学比较研究发现多耐药的AYE株存在AdeABC外排泵系统,而敏感株(SDF株)则无该外排泵系统[6]。如AdeABC外排泵过度表达与氨基糖苷类、氯霉素、四环素和某些β-内酰胺类药物耐药相关[7]。qacE△1为消毒剂及其它化合物外排泵的编码基因。可移动遗传元件标记基因intⅠ1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba120株PDR-ABA菌也均为阳性。由图1可见,1号株～16号株为同一克隆,均携带了TEM-1、PER、ADC-30、OXA-23、OXA-66、aac(3)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、adeB、qacE△1、intⅠ1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba1获得性耐药基因及相关元件；并且3种与耐药相关的看家基因均存在相同的有义突变。17号株～19号株亦为同一克隆,它们均携带了TEM-1、ADC-65、OXA-23、OXA-66、aac(6’)-Ⅰb、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、armA、adeB、qacE△1、intⅠ1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba1获得性耐药基因及相关元件；并且3种与耐药相关的看家基因均亦存在相同的有义突变。20号株携带了TEM-1、ADC-66、OXA-23、OXA-66、aac(6’)-Ⅰb、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、adeB、qacE△1、intⅠ1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba1获得性耐药基因及相关元件；并且3种与耐药相关的看家基因均存在有义突变。样本聚类分析时我们并引入了1株多耐药株(MDR)作为外簇群参照。

细菌的看家基因是否突变，获得耐药基因是否存在均为二元变量，是进行样本聚类分析较好的参数,获得耐药基因是否存在与抗菌药物敏感性表型相对应，便于观察分析。本组PDR-ABA菌对13种抗菌药物均耐药，即表型相同,但经耐药相关基因检测，并对结果进行样本聚类分析显示出3个簇群，其中二个为同一克隆的播散。十多年前，国外学者提出了采用MLST技术的亲缘性分析方法。而基于看家基因和水平转移基因的菌株亲缘性分析方法不仅考虑了看家基因,并同步加入了水平转移获得的耐药基因。因此从原理上比MLST法更趋合理。最新的报告提示,如不考虑水平转移基因该组菌株实例分析中将有15种阳性模式疏漏。

对细菌的临床分离株进行菌株亲缘性分析其实质就是对该组菌株进行系统发育学关系研究,观察各菌株之间的微进化。细菌在抗菌药物压力作用下,自身看家基因突变和外源性基因重组有可能同步进行,因此亲缘性分析应同步考虑看家基因和获得性基因必须的。目前,国内同行对耐药菌进行耐药基因检测已逐步普及,基于看家基因和水平转移基因的检测结果作样本聚类分析在不增加其它检测项目基础上,只是作进一步对结果作统计分析即可得到亲缘性分析结论，值得推广应用。

参考文献：

[1]姜如金，朱健铭，吴康乐.基于管家基因和水平转移基因的菌株亲缘性分析[J].中华医院感染学杂志,2011,21(18):3765-3769.

[2]赵旺胜,王芳,翁幸鐾,基于管家基因和水平转移基因的菌株亲缘性分析:60株耐药大肠埃希菌研究[J].南京医科大学学报(自然科学版),2012,32(1):109-114.

[3]FalagasME,KoletsiPk,BliziotisLA.Thepersityofdefinitionsofmultidrug-resistant(MDR)andpandrug-resistant(PDR)AcinetobacterbaumanniiandPseudomonasaeruginosa[J].JMedMicrobiol,2006,55:1619-1629.

[4]翁幸鐾,糜祖煌,金辉.多耐药大肠埃希菌获得性耐药基因检测及指标聚类分析[J].中华临床感染病杂志,2011,4(3):154-158.

[5]王春新,耿先龙,许亚丰,等.泛耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药相关基因与可移动遗传元件检测的指标聚类分析[J].南京医科大学学报(自然科学版),2012,32(1):115-118.

[6]FourmierPE,VallenetD,BarbeV,etal.ComparativeGenomicsofMultidrugResistanceinAcinetobacterbaumannii[J].PLoSgenetics,2006,2(1):e7.

[7]CoyneS,CourvalinP,Perichon.Efflux-MediatedAntibioticResistanceinAcinetobacterspp.[J].AntimicrobAgentsChemother,2011,55(3):947-953.