γ-维生素E对哮喘小鼠血清和肺泡灌洗液中Eotaxtin、IL-4的影响

γ-维生素E对哮喘小鼠血清和肺泡灌洗液中Eotaxtin、IL-4的影响

吴艳梅屈勇张莉莉杜小梅吕建宁

吴艳梅屈勇张莉莉杜小梅吕建宁

西安市西电集团医院陕西西安710077

【摘要】目的：探讨γ－维生素E抗哮喘的作用及机制。方法：将40只雄性小鼠随机分为正常组、哮喘组、治疗组，治疗组包括地塞米松组及γ-维生素E组(γ-T组)。给予小鼠腹腔注射及雾化吸入卵蛋白（OVA）建立哮喘气道炎症反应模型，测量小鼠血清和BALF中Eotaxtin、IL-4含量。用ANOVA检验组间差异，评价γ-维生素E抗哮喘的作用。结果：1.与哮喘相比较，治疗组小鼠血清及BALF中Eotaxtin、IL-4均明显下降，差距具有统计学意义(P＜0.01)；2.治疗组间比较Eotaxtin、IL-4浓度差异均无统计学意义(P＞0.05)；3.γ-T组及地塞米松组小鼠肺叶局部炎症反应均较哮喘模型组轻。结论：1.使用OVA联合佐剂氢氧化铝可成功建立小鼠肺部变态反应性模型。2.γ-维生素E可通过减少小鼠血液及BALF中Eotaxtin、IL-4含量减轻哮喘发作症状及肺部变态反应性炎症程度，治疗效果类似于地塞米松。

【关键词】γ-维生素E；哮喘；嗜酸性粒细胞趋化因子；IL-4

【中图分类号】R322.3【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）8-0227-02

支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着公众健康。随着社会和环境的发展，越来越多的研究认为哮喘与人类进食的营养素的缺乏或比例失调有关。其中脂溶性维生素E获得了极大的关注[1-3]。维生素E按甲基位置分为α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ生育三系酚。不同维生素E的异构体，其作用也不同[4]。其中γ-生育酚(γ-T)被认为与哮喘密切相关[5]。γ-T为天然维生素E，除具有促进生殖、维持中枢神经系统、心血管系统功能外，还具有调节免疫的作用[6]。它的代谢产物与花生四烯酸(AA)竞争COX-2的活性部位，特异性抑制环氧化酶(COX-2)，导致花生酸类物质减少[7]；减少前列腺素(PGE2)，白三烯(LTB4)和肿瘤坏死因子的释放等[8-10]。本实验旨在利用卵白蛋白（OVA）联合氢氧化铝凝胶激发构建哮喘小鼠气道炎症反应模型，用γ-T干预，探讨γ-T对哮喘后气道炎症程度及炎症因子嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxtin）和白介素4（IL-4)水平，为γ-T应用于临床提供理论依据。

1材料和方法

1.1动物与分组

4周龄健康小鼠40只（SPF级，雄性，体重18-20g），由西安交通大学实验动物中心提供，SPF级饲养。随机将分为4组：哮喘组、正常对照组、治疗组，治疗组包括地塞米松组、γ-T组，每组10只。

1.2试剂、器材和药物

OVA为美国Sigma公司产品；氢氧化铝凝胶为上海美兴化工股份有限公司产品；γ－T购自美国Sigma公司，纯化度95%；EotaxinELISA试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司，批号：20140401A；IL-4ELISA试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司，批号：20140601A；地塞米松磷酸钠为河南润弘制药股份有限公司产品；食用玉米油，为中粮北海粮油工业（天津）有限公司产品；超声雾化器、常温及低温离心机等。

1.3造模及给药

哮喘组及治疗组分别于第0、7、14天腹腔注射0.5mL致敏液（含OVA10μg＋氢氧化铝凝胶2mg）进行致敏；第21天开始激发，将小鼠置于自制密闭箱内，给予雾化吸入25g/L的OVA溶液30min，每日雾化1次，同时给予0.1mL玉米油灌胃，连续7天；γ－T组以上述同样的方法用OVA进行致敏和激发小鼠，并在每次激发前1h分别予以灌胃2mgγ－T及0.1mL玉米油；地塞米松组则在每次激发前1h分别予以腹腔注射地塞米松0.1mg及0.1mL玉米油灌胃；正常对照组则用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。

1.4小鼠血清中Eotaxin和IL-4含量测定

末次激发后24h，采用眼球放血法采血，收集血液于4mlEP管中，室温下静置2h左右；离心，收集上清，保存于-20℃冰箱中，采用ELISA法测定各组血清中Eotaxin和IL-4的浓度。

1.5小鼠BALF中Eotaxin和IL-4含量测定

小鼠眼球采血后，用颈椎脱臼法处死，迅速行支气管肺泡灌洗术：结扎左主支气管，对右肺进行灌洗。插管成功后用500?l/次预冷的PBS灌洗两次，收集灌洗液，回收率约80%。集上清，保存于-20℃冰箱中，待测。

1.6小鼠肺组织病理学检测

取各组未经支气管肺泡灌洗的另一半小鼠肺组织，排空肺内气体，用10%甲醛溶液固定过夜。经脱水透明处理、浸蜡、石蜡包埋、切片与贴片等一些列处理后，再脱蜡行HE染色切片。光镜下观察肺组织切片炎症浸润、水肿及气道上皮损伤情况留取小鼠肺组织。根据Underwood的标准对小气道和小血管周围的炎症进行病理评分。

表1Underwood的变应原激发肺部炎症改变的组织病理学评

1.7统计学方法

各组实验数据以表示，采用SPSS17.0软件进行统计学分析。用one-wayANOVA检验组间差异，当方差齐性时，用SNK-q检验进行两两间比较；当方差不齐时，采用Dunnett＇sc(U)检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组激发后哮喘发作情况

哮喘组在激发后30min内发作，哮喘组小鼠出现口唇发绀、呼吸急促，腹部翕动，烦躁不安，活动频繁，少动等表现，而γ－T干预组发作程度轻，地塞米松组发作程度最轻。正常组小鼠行动敏捷，未见异常。

2.2肺组织病理学改变

与正常组相比，哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚，肺脏小支气管血管外可见大量炎性细胞浸润，主要以单核及嗜酸性细胞为主，肺脏小支气管粘膜层杯状细胞增生。地塞米松可明显减轻炎性细胞的渗出并抑制杯状细胞增生。γ-T的干预亦部分逆转了上述炎性改变，肺脏小支气管外可见少量炎性细胞浸润，小支气管粘膜层杯状细胞增生减轻。见图、表2。

注：与空白对照组比较▼P<0.05▼▼P<0.01；与模型组比较*P<0.05**P<0.01

3讨论

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症和气道高反应性疾病。其中嗜酸性粒细胞起着重要的作用，Eotexin是由肺和支气管表皮细胞产生的与嗜酸性粒细胞趋化有关的因子，属于CC家族，其在嗜酸性粒细胞的黏附、募集和脱颗粒过程中发挥着重要作用。Eotexin通过受体CCR3选择性地诱导以嗜酸性粒细胞为中心的过敏性炎性细胞从血液中向支气管粘膜浸润，引起组织损伤。在支气管哮喘时，Eotexin及其受体高表达，使嗜酸性粒细胞及其它炎性细胞如Th2细胞、单核－巨噬细胞等向炎症部位移动，同时Eotexin与IL-4、IL-10、IL-10等Th2型细胞因子也有协同作用[11]。

IL-4是一种多效性细胞因子，在人体内IL-4可由多种细胞如CD4+Ｔ细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞等激活后表达和释放，其在细胞因子网络中居于中心地位。哮喘的发病机制主要有：气道炎症，免疫反应，神经机制，气道高反应性和遗传因素等，具体机制尚不明确[12]。目前认为，免疫因素中Th1/Th2免疫应答失衡在哮喘的发展和持续中发挥重要作用，哮喘发作时Th2型免疫应答占优势，此时Th0向Th2分化增多。Th2细胞可分泌多种促炎介质，如白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-10和IL-13等，这些细胞因子可活化B淋巴细胞，进而促进特异性IgE合成、肥大细胞和嗜碱性粒细胞分化、杯状细胞高分泌和支气管高反应性等[13]，IL-4与哮喘患者慢性气道炎症的产生和维持也有密切关系[11]。IL-4是Th1/Th2分泌的炎症促进因子，能诱导Th0转化为Th2，同时促进Th2分泌IL-5、IL-8、IL-12、IL-13和炎症促进因子，间接抑制Th1分泌IFN、IL-12等炎症抑制因子，存在着Th2优势的免疫应答，如果能逆转其失衡状态促使Th1/Th2免疫应答的动态平衡将有利于哮喘的预防和治疗[14]。

研究显示γ-T与支气管哮喘有紧密联系，γ-T的代谢产物可以竞争性抑制花生四烯酸(AA)COX-2的活性部位，导致花生酸类物质、前列腺素(PGE2)，LTB4生成减少[8-10]。本研究通过γ-T干预OVA诱导的哮喘小鼠模型，发现γ-T干预可以明显降低小鼠哮喘急性发作程度及气道炎症程度，降低肺泡灌洗液中Eotexin及IL-4水平，效果与地塞米松作用相当。提示γ-T通过降低肺组织局部Eotexin和IL-4水平，从而抑制嗜酸性粒细胞的黏附、募集和脱颗粒等，减轻肺组织局部炎性反应及组织损伤，从而抑制哮喘急性发作期的气道炎症反应。另一方面γ-T通过降低IL-4的含量逆转Th1/Th2免疫应答失衡状态从而有利于哮喘的预防和治疗。

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