EB病毒相关胃癌组织中VEGF表达的研究

EB病毒相关胃癌组织中VEGF表达的研究

孙萍1罗兵2周冬梅3

孙萍1（通讯作者）罗兵2周冬梅3

(1烟台毓璜顶医院山东烟台264000)

(2青岛大学医学院微生物教研室山东青岛266003)

(3烟台市烟台山医院山东烟台264001)

【摘要】目的:检测EBV相关胃癌（EBVassociatedgastriccarcinomas，EBVaGC）和与之匹配的EBV阴性胃癌（EBVnetativegastriccarcinomas，EBVnGC）VEGF的表达，同时检测EBV相关基因的表达，探讨它们在EBVaGCs发生发展中的作用。方法:选取13例EBVaGCs、45例与之相匹配的EBVnGCs和58例相应癌旁组织作为研究对象，采用免疫组化技术检测VEGF蛋白的表达；RT-PCR和Southern杂交技术检测EBV相关基因（核抗原EBNA1和EBNA2编码基因，潜伏膜蛋白LMP1编码基因，早期基因BARF1和BHRF1）的表达。结果:①癌组织VEGF阳性率为72.41%(42/58)，明显低于相应癌旁组织87.93％(51/58)(P=0.022)；EBVaGC组织中VEGF阳性表达率为84.61%（11/13），明显高于EBVnGC组织68.9%（31/45），两组间差别有统计学意义(χ2=3.928，P=0.047)②13例EBVaGCsEBNA1mRNA均为阳性，而EBNA2和LMP1mRNA均为阴性；早期基因中有6例BARF1表达阳性，2例BHRF1表达阳性。结论:①EBVaGC及EBVnGC中高表达VEGF，但是EBVaGC中VEGF的表达与血管生成和淋巴结转移关系密切程度不如EBVnGC②EBVaGC组织中LMP1和EBNA2表达阴性，与c-myc的表达和细胞增殖无明显相关性，早期基因BARF1和BHRF1可通过转化细胞等作用促进肿瘤的发生发展。

【关键词】胃癌EB病毒VEGFRT-PCR

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）20-0128-03

EB病毒（Epstein-BarrVirus，EBV）是重要的致瘤病毒，以往的研究多集中在EBV与Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤等的关系，近年来研究发现约7～16%的胃癌组织EBV阳性，EBV感染在胃癌发生发展中的作用也愈来愈受到重视。本研究采用免疫组化方法检测13例EBVaGCs、45例与之相匹配的EBVaGCs以及相应癌旁组织中VEGF的表达，RT-PCR检测EBV相关胃癌组织中病毒潜伏期基因EBNA1、EBNA2、LMP1以及早期基因BARF1和BHRF1的表达，以探讨EBVaGC中EBV相关基因与PCNA和c-myc基因表达的关系及在胃癌发生发展的作用。

1材料和方法

1.1研究对象：

随机选取青岛大学医学院附属医院、青岛市立医院及烟台毓璜顶医院2008年1月～2009年12月间185例胃癌患者手术切除的新鲜胃癌组织和相应癌旁组织(距离癌组织5cm以上)制备组织切片，经PCR-Southern和原位杂交检测证实185例胃癌中有13例EBVaGCs，同时选择年龄、性别、病理类型和临床分期与之相匹配的45例EBVnGCs作为研究对象。58例胃癌病人平均年龄58岁(31～81岁)，其中男性48例，女性10例，全部病例均经病理诊断证实。

1.2主要试剂和耗材：

ReverseTranscriptionkit(美国Promega公司)，TRIzol试剂(美国GIBCO公司)，PCR反应体系（上海生工生物技术服务有限公司），Hybond-N+尼龙膜(美国Amershampharmacia公司)，DigOligonucleotide3’-EndLabilingkit、CSPD、DNAMolecularWeightMarkerⅧ，Digoxigenin-Labeled（徳国Roche公司），VEGF兔抗人单克隆抗体、SP通用型染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3EBV相关基因的RT-PCR及Southernblotting检测

TRIzol法提取组织总RNA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件进行cDNA合成，反转录所得cDNA用作PCR反应的模板。EBV潜伏期基因和早期基因特异性引物和探针均参照文献设计[1-3]，由北京赛百胜公司合成，引物和探针序列以及PCR产物长度见表1。应用Roche公司提供的DigOligonucleotide3’-endLabelingKit对寡核苷酸探针进行标记,具体步骤按试剂盒要求的标准条件进行。

PCR反应体积为30μl，反应体系为10×buffer3μl，MgCl21.5mmol/l，dNTP0.1mmol/L，上下游引物各0.5μmmol/L，TaqDNA聚合酶1.0U，cDNA聚合酶1U，cDNA模板3μl，同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为EBV阳性的LCL细胞，阴性对照为EBV阴性Ramos细胞系。PCR反应条件为94℃预变性5min；然后94℃45sec，58℃45sec，72℃1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。内参照基因GAPDH扩增25个循环，循环参数除复性温度为55℃外，其余条件同上。

取PCR扩增产物10μl于含溴化乙锭(0.5μg/ml)的2%琼脂糖凝胶中电泳，80V，1h，紫外透射仪下观察结果并拍照，然后用碱变性法将电泳结果转印至Hybond-N+尼龙膜进行Southernblotting检测。

1.4免疫组化检测VEGF的表达

采用免疫组化抗原热技术检测VEGF的表达，一抗为1：100稀释的兔抗人VEGF单克隆抗体，用PBS代替一抗作阴性对照；用已知VEGF阳性的乳腺癌标本做阳性对照。

免疫组化结果判断标准为：VEGF定位于细胞浆,染色强度得分标准为：淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分；阳性细胞百分比评价标准为：＜5%者记0分，5﹪～25﹪记1分，26﹪～50﹪记2分，51﹪～75﹪记3分，≥75﹪记4分。2个分值相加1～2分者为弱阳性(+),3～4分者为阳性(++),5～6分者为强阳性(+++)。1～2分者为弱阳性(+),3～4分者为阳性(++),5～6分者为强阳性(+++)。

1.5统计学处理

所得数据用spss统计软件分析处理，计量资料用均数±标准差表示，实验结果采用t检验和卡方检验。P＜0.05为差异有统计意义。

2结果

2.1EBVaGC组织中病毒相关基因的表达

13例EBVaGCs组织中均检测到内参照基因GAPDH的表达，表明cDNA完整和PCR反应成功。13例EBVaGCs组织中均检测到EBV核抗原EBNA1基因的mRNA，而EBNA2和LMP1mRNA均为阴性。有6例检测到EBV早期基因BARF1的表达，2例检测到EBV早期基因BHRF1的表达，RT-PCR-Southern检测结果见图1。

图1RT-PCR-Southern检测EBVEBNA1，EBNA2，LMP1，BARF1以及BARF1基因的表达

2.2VEGF免疫组化检测结果

VEGF阳性信号定位于细胞浆，图2～图3为EBVaGC和EBVnGC免疫组化检测结果。免疫染色结果表明，58例胃癌组织VEGF阳性率为72.41%(42/58)，癌旁组织中VEGF阳性率为87.93％(51/58)，明显高于癌组织（χ2=5.208，P=0.022）。胃癌组织中VEGF表达与性别、年龄、肿瘤大小无明显相关性，与病理分级、淋巴结转移、浸润深度、临床分期明显相关。病理分级越低VEGF表达率越高（χ2=6.649，P=0.010），有淋巴结转移者VEGF阳性表达率明显高于无转移者（χ2=5.945，P=0.015），随肿瘤组织浸润的加深VEGF阳性率升高（χ2=4.437，P=0.035），临床分期Ⅲ～Ⅳ患者VEGF阳性率高于Ⅰ～Ⅱ（χ2=7.880，P=0.005）。各临床病理因素分组中癌旁组织VEGF阳性率明显高于癌组织，差异有统计学意义，结果见表1。EBVaGC组织VEGF阳性表达率为84.61%（11/13）高于EBVnGC组织VEGF阳性表达率为68.9%（31/45），两者比较差异有显著性意义(χ2=3.928，P=0.047)。EBVaGC中VEGF过表达率30.8%（4/13），EBVnGCVEGF过表达率13.3%（6/45），差别有统计学意义(χ2=4.989，P=0.037)，结果见表2。

表2EBVaGC与EBVnGC中VEGF表达的比较

3讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤最本质的生物学特征，也是导致患者治疗效果不佳乃至死亡的主要原因之一。肿瘤的发生、发展及其侵袭转移是一个多因素、多阶段的复杂过程,而血管生成是其重要的前提条件之一，VEGF是恶性肿瘤细胞分泌的最重要的促血管生成因子[1]。许多研究表明VEGF表达与胃癌恶性生物学行为相关(浸润深度、淋巴结转移),并且与进展期及早期胃癌预后有关[2,3]。EBV隐性膜蛋白基因LMP1在NPC中被证实可直接或间接上调细胞核中的EGFR，LMP1可能模拟活化的ras通路而诱导EGFR表达[4]，LMP1可以通过激活NF–kB转录活性上调COX-2的表达，后者可以促进VEGF的表达[5]。在NPC的细胞系中LMP1可通过TRAFS上调EGFR表达，又可促进NPC细胞的EGF分泌，且使EGF与EGFR结合。但胃癌组织中EBV上调VEGF机制尚不明了。Yoshizaki等[6]通过对NPC病人病灶的微血管密度(microvaslulardensity,MVD)和LMP1的检测，发现两者有明显的相关性，前者与NPC的转移有密切的关系。本研究表明EBVaGC组织VEGF阳性表达率高于EBVnGC组织，表明EBVaGC组织中VEGF与血管生成关系不如EBVnGC密切，这显然不同于EBV对NPC的作用，具体机制有待于进一步研究。

近年来EB病毒早期基因BARF1颇受重视，被认为是继LMP1后第二个EB病毒癌基因，研究表明有人认为BARF1基因产物能激活细胞原癌基因c-myc和bcl-2的表达[7，8]。Zur等[9]在90％的EBV感染相关性胃肠道肿瘤中检测到BARF1mRNA转录，但LMP1mRNA阴性,BARF1蛋白颗粒大量存在于上皮肿瘤细胞中，因此认为EBV阳性胃癌中BARF1可能代替LMP1起到致癌作用。本实验6例EBVaGCs表达BARF1，进一步证实了上述观点,但EBVaGC组织中BARF1基因与细胞增殖的关系尚需增加病例进一步研究。

EBV早期基因BHRF1与bcl-2的基因序列具有高度的同源性，BHRF1与bcl-2基因一样，可抑制细胞凋亡的发生，促进细胞的生长和转化，延长细胞寿命。Huang等[10，11]构建了鼻咽癌CNE2细胞系的EBVBHRF1高效表达克隆，检测其经60Co照射后的生物活性改变。结果表明鼻咽癌中EBVBHRF1的表达能够抑制PCNA的表达，减少细胞对射线的敏感性，增强肿瘤细胞在营养不良情况下的生存能力，从而有利于肿瘤的发生发展。本研究中仅2例EBVaGC组织中检测到BHRF1基因的表达，其余11例均未检测到其表达，提示BHRF1基因表达与细胞增殖无明显相关性，结合Huang的研究推测在正常情况BHRF1对细胞增殖并无直接作用，但在某些特殊情况如营养不良时可能通过抑制细胞增殖，增强其抗凋亡能力，从而促进肿瘤的发展。

参考文献

[1]DuJR,JiangY,ZhangYM,etal.Vascularendothelialgrowthfactorandmicrovasculardensityinesophagealandgastriccarcinomas[J].WorldJGastroenterol,2003,9(7):1604-1606.

[2]FondevilaC,MetgesJP,FusterJ,etal.p53andVEGFexpressionareindependentpredictorsoftumourrecurrenceandsurvivalfollowingcurativeresectionofgastriccancer[J].BrJCancer,2004,90(1):206-215.

[3]ArdilaOsorioH,PiocheDurieuC,PuvionDntilleulF,eta1.TRAFinteractionswithraftlikebuoyantcomplexes,betterthanTRAFratesofdegradation,diferentiatesignalingbyCD40andEBVlatentmembraheprotein1[J].IntJCancer,2005,3(2):267-275.

[4]ShigeyukiM,HiroyasuI,TadashiT,eta1.Inductionofcyclooxygenase-2byEpstein–Barrviruslatentmembraneprotein1isinvolvedinvascularendothelialgrowthfactorproductioninnasopharyngealcarcinomacells,ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(12):6905-10.

[5]YoshizakiT,HorikawaT,Qing-ClhunR,eta1.Inductionofintefleukin8byEpstein-BarrViruslatentmembraneproteinlanditscolletelationtoangiogenesisinnasopharyngealcarcinoma[J].ClinCancerRes,200l,7(7):l946-1951.

[6]FinnL,DougertyG,FinleyG,etal.AlternativesplicingofCD44pre-mRNAinhumancolorectaltumor[J].BiochemBiophysResCommun,1994,200:1015-1017.

[7]ShengW,DecaussinG,SumnerS,etal.N-terminaldomainofBARF1geneencodedbyEpstin-BarrvirusisessentialformalignanttransformationofrodentfibroblastsandactivationofBCL-2.Oncogene.2001,20(10):1176-1185.

[8]ShengW,DecaussinG,LigoutA,etal.MalignanttransformationofEpstein-Barrvirus-negativeAkatacellsbyintroductionoftheBARF1genecarriedbyEpstein-Barrvirus.JVirol.2003Mar,77(6):3859-3865.

[9]zurHausenA,BrinkAA,CraanenME,etal.UniquetranscriptionpatternofEpstein-Barrvirus(EBV)inEBV-carryinggastriccarcinomas:expressionofthetransformingBARF1gene.CancerRes.2000,60(10):2745-2748.

[10]HuangH,PanX,YuL.TheeffectofEpstein-BarrvirusgeneBHRF1expressionontheapoptoticresistanceofnasopharyngealcarcinomacells.ZhonghuaZhongLiuZaZhi.1998Jul,20(4):245-247.

[11]HuangH,PanX,SunX.TheeffectoftheexpressionofBHRF1geneofEBvirusontheproliferationofthecellsofnasopharyngealcarcinoma.ZhonghuaErBiYanHouKeZaZhi.1997Oct,32(5):290-292.

基金项目：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目，项目编号：2007BS02012