复方地黄软膏无菌检查法的方法建立

复方地黄软膏无菌检查法的方法建立

董翼虎

（广元市食品药品检验检测中心四川广元628000）

【摘要】目的：建立复方地黄软膏的无菌检查法。方法：供试品采用《中国药典》2015年版四部无菌检查法中直接接种法，对样品进行稀释并培养14天，再转种继续培养3天，同时用阴性和阳性对照。结果：供试品在继续培养3天后无菌，阳性对照在培养3天后生长良好。结论：该方法能除去复方地黄软膏的抑菌作用，使无菌检查结果准确可靠，可作为复方地黄软膏的无菌检查法。

【关键词】复方地黄软膏；无菌检查；建立

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）27-0037-02

ToestablishFufangDihuangRuangaosterilitytestmethodDongYihu.

ThefoodanddruginspectiontestingcenterinGuangyuan628000

【Abstract】ObjectiveToestablishFufangDihuangRuangaosterilitytestmethod.MethodsThetestused“ChinesePharmacopoeia”(ChP)2015editionofappendixdirectinoculationsterilitytestmethodinthemethodofdilutionandculturedfor14days,sub-culturedfor3daysinoculation,bothwithnegativeandpositivecontrols.ResultsThetestcontinuedtotrain3daysinsterile,positivecontrolcontinuedtogrowwellculturedfor3days.ConclusionThismethodcanremovetheinhibitoryeffectofFufangDihuangRuangao,sothatsterilitytestresultsisaccurateandreliable,anditcouldbeusedforthequalitycontrolofthepreparation.

【Keywords】FufangDihuangRuangao;Sterilitytest

复方地黄软膏是由地黄、黄连、黄柏、黄芩、麦芽、甘草等组成，以芝麻油为辅料，蜂蜡为基质，具有清热燥湿，凉血解毒，祛腐生肌的功效[1]。复方地黄软膏是医疗机构自制制剂，未收载于国家法定标准，需对其无菌检查方法进行建立并验证。该品种系半固体外用制剂，含有盐酸小檗碱等抑菌成分，无菌检查法如直接采用薄膜过滤法，无法过滤，因此采用直接接种法进行试验。

1.仪器和材料

1.1仪器

BSC-1000ⅡA2生物安全柜；SW-CJ-1C超净工作台；DNP-9082电热恒温培养箱；SPX-150B生化培养箱等。

1.2培养基

硫乙醇盐流体培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红纳琼脂培养基，营养肉汤培养基，培养基标的生产厂家为：中国食品药品检定研究院。助溶剂：聚山梨酯-80（分析纯）菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，来源均为：中国食品药品检定研究院。样品由四川省广元监狱医院提供。

1.3试验环境

试验环境采用C级背景下的局部A级（C+A），单向流空气区、工作台面及环境定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。检验前开启空气净化系统40分钟以上，检验过程中对试验环境进行监控。

2.方法与结果

2.1无菌检查法的方法学验证

2.1.1菌液制备取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌和枯草芽胞杆菌的肉汤新鲜培养物、生孢梭菌硫乙醇盐液体培养物各1ml，分别加入9ml的无菌氯化钠溶液（0.9%）中，10倍系列稀释至使菌数约为50～100cfu·ml-1。取经25℃培养18～24h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml，加入9ml的无菌氯化钠溶液（0.9%）中，10倍系列稀释至使菌数约为50～100cfu·ml-1。取经25℃培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加10ml的无菌氯化钠溶液（0.9%），将孢子洗脱，后吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（已灭菌）过滤，除去菌丝，收集菌液至另一无菌试管内作为菌原液。取此菌原液0.1ml，加入9.9ml无菌氯化钠溶液（0.9%）中，稀释使使菌数约为50～100cfu·ml-1。上述菌液均进行菌液计数，以两个培养皿的平均数进行计数，见表1。

表1细菌和真菌计数结果（cfu·ml-1）

2.1.2培养基无菌性检查每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，无菌生长。

2.1.3培养基灵敏度检查取不含聚山梨酯-80的硫乙醇盐流体培养基和含15%聚山梨酯-80的硫乙醇盐流体培养基各5瓶，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各一瓶，另一瓶不接种为阴性对照，均置于30～35℃培养3d。另取不含聚山梨酯-80的改良马丁培养基和含15%聚山梨酯-80的改良马丁培养基各3瓶，分别接种小于100cfu的色念珠菌、黑曲霉菌各一瓶，另一瓶不接种为阴性对照，均置于323～28℃培养5d。逐日观察记录。结果该培养基的灵敏度检查符合规定。

2.1.4验证实验取含聚山梨酯-80的硫乙醇盐流体培养基8瓶（500ml），分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各两瓶。均置于30～35℃培养3d。取含聚山梨酯-80的改良马丁培养基4瓶（500ml），分别接种小于100cfu的色念珠菌、黑曲霉菌各两瓶。另取两瓶，其中一瓶加入样品50ml，另一瓶作为对照。均置于323～28℃培养5天。每天观察并记录结果。由表2可知，与阳性管比较，含样品各管在3～5d内均生长良好，而硫乙醇盐流体培养基和改良马丁培养基阴性对照管内5d均无菌生长，说明该检验量的样品在上述条件下无抑菌作用，此无菌检查方法可行。

表2方法验证实验结果

2.2复方地黄软膏无菌检查法

2.2.1样品制备取复方地黄软膏30瓶/批，按无菌操作法，称取样品50g，接种至含15%聚山梨酯-80的硫乙醇盐液体培养基中，接种11瓶（500ml/瓶）（其中中一瓶作阳性对照，加入小于100cfu金黄色葡萄球菌）；接种含15%聚山梨酯-80的改良马丁培养基10瓶。在各瓶中分别加入灭菌玻璃珠，加热至38～40℃，充分振摇混合后，置培养箱中培养。

硫乙醇盐流体培养基在30～35℃的条件下，改良马丁培养基在23-28℃条件下培养14天。培养期间逐日观察并记录，培养基未出现浑浊，无菌生长。取出培养液，按无菌操作规程操作，摇匀，各取硫乙醇盐液体培养液1ml，分别转种到10支制备好并灭菌的15ml/支硫乙醇盐流体培养基中，培养3天；各取马丁培养液1ml，分别转种到10支制备好并灭菌的15ml/支改良马丁培养基中，培养5天。同时，分别用含15%聚山梨酯-80的硫乙醇盐液体培养基和含15%聚山梨酯-80的改良马丁培养基作阴性对照。阳性对照管生长良好，阴性对照管无菌生长，试验有效。硫乙醇盐流体培养基和改良马丁培养基目测均无细菌生长，分别取培养液涂片，染色，镜检，也未检出细菌，表明样品符合《中国药典》2015年版的规定。结果采取先培养14天，再转种后培养的方法进行无菌检查，结果符合规定。

3.讨论

根据《中国药典》2015年版四部1101无菌检查法的规定，只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法[2]。首先考虑采用薄膜过滤法，但复方在地黄软膏在常温下为半固体，取规定样品量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品与十四烷酸异丙酯混匀，即使加热不超过44℃，粘稠度很大，趁热仍无法过滤。考虑到医院生产样品的批量较小，如采用十四烷酸异丙酯供试液加入稀释液萃取的方法，用量大，成本过高。综合考虑样品的性质，检验成本和医院的检验条件，本实验采用直接接种法。该方法操作相对简便，样品经稀释后浓度大大降低，能消除样品的抑菌作用，同时又不影响样品有菌时的检出。本实验经过比较5%，10%，15%，20%四种浓度的聚山梨酯-80作方法学验证比较，验证结果15%聚山梨酯-80为助溶剂时，回收率最高，不影响阳性菌的生长。操作过程应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

本实验采用直接接种法，又考虑到稀释液和培养基对实验的影响因素，以验证实验结果的可靠程度，该结果可以作为复方地黄软膏无菌检查的方法。

【参考文献】

[1]王昭洪，曾涛.复方地黄软膏治疗烧伤893例[C]//四川省药学会第七次全省会员代表大会暨学术年会论文集.2011.

[2]中国药典[S].2015年版四部.北京:中国医药科技出版社，2015，136.