实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

李亚萍

李亚萍

（无锡市江阴利港医院超声科；江苏无锡214444）

【摘要】探讨：乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA量之间的关系，分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用。HBVDNA定量是目前诊断乙型肝炎、判断病毒复制和评价患者肝脏病变、预后及药物疗效的重要指标之一，但在指导诊疗时仍需结合血清标记物、肝损害指标乃至HBV基因分型。方法：PCR核酸探针杂交法、RELISA、竞争定量PCR、实时荧光定量PCR，本文综述定量检测HBVDNA意义及PCR检测方法。结论:实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA是反映HBV复制水平的可靠指标，有助于疾病的诊断及预后判断。

【关键词】乙型肝炎病毒核糖核酸实时荧光定量PCR

全世界超过20亿人感染过乙肝病毒，大约3.5亿人为乙型肝炎患者，每年约有100万人死于乙型肝炎病毒相关的肝硬化和肝癌。而我国更是全球乙型肝炎的高发国家之一，人群乙型肝炎病毒HbsAg的携带率高达10%。多年以来临床诊断HBV感染情况通常采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒血清标志物模型(HBV-M，俗称两对半)，以了解和判断乙型肝炎病毒在体内的复制水平、传染性强弱等，对乙型肝炎的诊断、抗病毒疗效观察及预后判断均具有重要意义。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的，可以定量检测HBV-DNA，由于其灵敏、快速、假阴、假阳性率极低，该技术已被广泛应用于临床检测，结合ELISA检测能够更为精确地了解HBV的感染情况。以下就对HBVDNA定量在诊断治疗上的定量原理和意义、定量方法作综述，探讨乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA数量之间的关系，分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用。

1HBVDNA含量与血清标记物(HBVM)的关系

1.1HBVDNA含量与HBeAg抗HBe

HBeAg阳性是病毒复制活跃的标志，HBeAg阳性与检出HBVDNA的符合率接近100%，两者存在极强的相关性。一般认为若HBeAg阴性或抗HBe阳性，则提示HBV复制减弱，病情得到控制。但大量文献指出，HBeAg转阴或抗HBe的出现并不说明病毒复制被控制，约50%抗HBe阳性的患者血清检出HBVDNA。单春梅等指出这可能是因为HBVDNA前C／C区基因变异，1896位G→A突变，原来TGG变成终止子(TAG)，丧失HBeAg合成分泌功能，逃脱细胞毒T淋巴细胞(CTL)的免疫攻击。这种变异在我国乙肝患者中普遍存在，是导致病情迁延、发生慢性肝炎、甚至肝硬化重要原因之一。

1.2HBVDNA含量与HBsAg／抗HBs

HBsAg阳性代表机体感染HBV，不代表复制情况；HBsAb为中和抗体，标志着机体产生免疫力。HBsAg阴性不能排除HBV的感染，Liang等报道36例HBVM均阴性的慢肝患者，PCR检测有11例(31%)HBVDNA阳性。范火亮从健康体检者抽取100份全阴标本，其中有2份PCR检测HBVDNA为阳性，说明ELISA检测HBVM全阴并不表示无HBVDNA复制。分析可能有几种原因：HBV的S区点突变导致HBsAg抗原性改变，HBsAg不被检出；急性感染的窗口期；HBsAg检测方法灵敏度不足；血清亚型的漏检等。

1．3HBVDNA含量与HBV前S1蛋白(PreS1)、前S2蛋白(PreS2)、大蛋白(LP)的关系

PreS1具有高度的免疫原性，在HBV感染和机体免疫应答过程中起重要作用，PreS1在乙肝早期诊断中有重要作用，能够反映HBV的复制情况，PreS1阳性与HBVDNA阳性有显著性相关，PreS1抗原与HBVDNA符合率为652%。

PreS2有较强的免疫原性，反映HBV复制的表型指标。乙型肝炎患者PreS2与HBeAg、HBVDNA呈伴随关系，PreS2的阳性率比HBVDNA高，PreS2抗原与HBVDNA符合率为764%。但PreS2不可替代HBVDNA。PreS1、PreS2反映HBV的复制活跃比HBeAg更敏感。

1．4HBVDNA含量与肝功能

有资料显示，血清HBVDNA的含量与肝功能指标均无相关性。张永红等指出HBVDNA和肝实质损害指标ALT、AST、PAB、ALB、TBIL、PT均不存在相关性，P＞005，说明HBVDNA载量并不反映肝功能受损的程度。HBV通过刺激宿主的免疫系统攻击受感染的肝细胞，间接引起肝损伤，HBV的肝细胞免疫病理损伤以T淋巴细胞毒反应为主，靶抗原的表达是决定靶细胞破坏的重要因素之一，肝细胞膜上表达的HBcAg、HBeAg、前S1蛋白和前S2蛋白是CTL攻击的主要靶抗原。

2HBVDNA定量的临床意义

HBVDNA是直接反应HBV复制状态及传染性的最佳指标，可用于判断乙肝感染的严重程度和传染性。HBVDNA的含量对观察抗病毒药物疗效、参考药物的剂量、用药时间以及是否需要联合用药有重要意义。在临床工作中利用血清HBVDNA载量判断患者病情、预后及指导抗病毒药物的应用，要结合ALT含量、HBVM，乃至PreS1、PreS2、LP联合检测。献血员窗口期病毒核酸的筛查以及早期诊断。HBsAg在血清中的检出通常在乙肝病毒感染后的2～4个月出现，HBVDNA的检测可将“窗口期”提前到6～15天，对早期诊断和输血的安全性有重要的意义。监测肝损伤的程度、预测病情、判断预后。

3HBVDNA定量的方法

3.1PCRELISA

3.1.1HBVPCR微板核酸杂交定量法

采用PCR扩增HBVDNA的S区，将扩增产物与包被探针及显色探针在微孔板内进行双探针杂交及ELISA显色，定量检测HBVDNA。该技术特点是在液体中进行杂交、杂交时间缩、操作简便、特异性高、仪器要求不高、价格便宜。李成德等［14］用realtimePCR检测HBVDNA，并与微板杂交法的结果进行比较，realtimePCR的灵敏度高10～50倍；样本批内变异系数均更低。微板杂交法难以避免扩增产物的污染，自动化程度低，影响定量的准确性。

3.1.2COBASAmplicor系统检测

HBVDNA是PCR定量方法的金标准，其具有良好的准确性和重复性。其特点是：采用内对照有效监控核酸抽提、扩增的效率，能消除反应体系中干扰因素的影响，但试剂昂贵，难以推广使用。肖艳群等比较realtimePCR与COBASAmplicor系统，realtimePCR省时、费用相对较低，易为临床实验室接受，灵敏度虽低于COBASAmplicor，但检测下限103copies／mL能满足临床检测的需要，有较好的重复性，与COBASAmplicor有良好的相关性。

3.2竞争定量PCR(cPCR)

cPCR是在同一反应管中，待测模板与竞争模板用同一对引物同时扩增，其中一个引物标记荧光，酶切后电泳或高效液相法分开两种产物，测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。定量的基础是假设扩增效率没有差别，且竞争模板难制备，影响定量准确性。PRSimpson等用竞争定量PCR检测HBVDNA，竞争模板为合成并扩增的HBs基因，用闪烁接近法(scintillationproximityassay，SPA)分析PCR扩增产物，分别计数，不需要分离过程，一般cPCR的灵敏度为103copies／mL，SPA法分析产物要损失灵敏度，提高特异性，方法灵相当于4×103copies／mL，线形范围在4个数量级左右。

3.3实时荧光定量PCR(realtimePCR，RTPCR)

realtimePCR是在PCR体系中加入荧光染料或荧光标记探针，在激发光的作用下释放荧光光能，荧光强度的变化可以动态反映PCR扩增产物量的变化，通过自动化仪器对荧光的采集与分析来实现对初始模板的检测和定量。

4实时荧光定量PCR检测HBV-DNA和Elisa法检测HBV的结果对比

2013年5月至2013年6月收集HBV感染血清标本165例，主要仪器有ABI7500实时荧光定量PCR仪和Ther-moMK3酶标仪。检测结果，见表1。

5讨论

Elisa法检测血清标本中的HBV-M是HBV感染病原学诊断的传统指标，该方法方便快捷，且技术成熟，对判断患者感染HBV情况有着重要的作用。但是ELISA检测是通过血清中的蛋白标志物间接地了解HBV的复制情况，依赖于人体免疫反应，有一定的滞后期，不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。同时由于乙型肝炎病毒感染窗口期和基因变异的存在，ELISA检测还有假阴性可能，会严重影响乙型肝炎的检测和治疗。而荧光定量PCR技术弥补了传统ELISA检测HBV的不足，直接检测血清中乙型肝炎DNA，判断患者体内是否存在病毒颗粒复制。由于HBV复制减弱，导致HBeAg水平低于检测限，但是并未停止复制，在HBVDNA检测中浓度多在103－104；乙型肝炎病毒前C区发生突变，导致e抗原分泌障碍，但是乙型肝炎病毒DNA仍旧继续复制。后面一个解释同样适用于HBsAg、HBcAb阳性组合，居高不下的HBVDNA水平使得这些患者具有很强的传染性，这是单独进行ELISA试验所不能提供的信息。综上，判断乙型肝炎患者是否具有传染性方面，FQ-PCR检测较ELISA检测更为直接明了，但是HBV-M指标检测同时还反映了人体对于病毒的免疫反应，在判断疾病进程方面有更为显著的作用，因此两者是互补互存的关系，结合起来将更加有利于病情和病程的判断。

6结论

总之，在诊断治疗乙型肝炎的过程中，HBVDNA定量越来越受到重视，通过HBVDNA定量，结合检测血清标记物、肝损害指标、HBV基因分型以及检测一些和复制有关的蛋白如PreS1、PreS2、LP，能更准确地判断患者病情、预后及指导抗病毒药物的应用。实时荧光定量PCR法灵敏度高、特异性强、快速、自动化程度高、且易于推广。国内临床上用于HBVDNA定量的方法基本都是实时荧光定量PCR测定，试剂购买商业试剂盒，灵敏度、特异性、稳定性等都能满足要求，但也存在容易污染的问题，并且仪器和试剂盒的成本还不能被大多地区接受。仍需进一步研究增加方法可靠性，并降低检测成本。

参考文献：

［1］朱永芳编实用荧光聚合酶链反应(PCR)技术［M］北京：中国计量出版社，2003

［2］梁晓峰，陈园生，王晓军等中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究［J］中华流行病学杂志，2005，26：655～658

［3］单春梅，王万相乙型肝炎患者HBVDNA与HBVM及HBVDNA前C／C区变异的对比研究［J］实用医技杂志，2006，13(10)：1629～1631

［4］姜燕，姜宏，黄园园乙型肝病毒感染者血清HBeAg模式与HBVDNA定量关系的研究［J］临床肝胆病杂志，2005，21(5)：281～282