双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用唐保晖黄丽华吴林洪韦晓仙

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用唐保晖黄丽华吴林洪韦晓仙

唐保晖黄丽华吴林洪韦晓仙

唐保晖黄丽华吴林洪韦晓仙(河池市疾病预防控制中心广西河池547000）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）6-0097-02

【摘要】目的探讨双重实时荧光PCR技术检测手足口病肠道病毒的应用效果。方法用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸，比较两种方法检测结果。结果240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份，EV71阳性1份,其他肠道病毒45份，单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份，EV71阳性1份，CoxA16+EV71阳性2份，其他肠道病毒45份。EV71和其他肠道病毒符合率为100%。结论双重实时荧光PCR检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒，且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果，是一种快速检测手足口病病毒的方法。

【关键词】双重实时荧光PCR手足口病

手足口病是由一组人肠道病毒（EV）感染引起的急性传染病，引起手足口病疫情的病原体以肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最为常见[1]。手足口病的诊断不仅要根据临床症状和体征进行诊断,还需要实验室检测作为辅助诊断，而实验室诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断。在疫情暴发时，为了提高检测速度，多使用分子生物学方法。目前，分子生物学诊断有两种方法：逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光PCR（包括单荧光PCR和多重荧光PCR）。本实验室从2010年起,手足口病检测采用的方法是单一实时荧光PCR技术,取得了满意效果,但笔者为了建立双重实时荧光PCR技术平台,探讨双重实时荧光PCR技术检测手足口病肠道病毒的应用效果，我们应用双重实时荧光PCR和单一实时荧光PCR对临床疑似手足病标本进行检测分型，并比较检测结果。

1材料与方法

1.1标本来源所检测的240份肛拭子标本为2011年4月～7月河池市所辖县（市）区疾病预防控制中心送检的疑似手足病监测标本。

1.2主要试剂病毒核酸提取试剂盒HighPureViralRNAKit为Roche公司生产；单荧光手足口病病毒核酸检测试剂盒为北京金豪制药股份有限公司生产；双重实时荧光手足口病病毒核酸检测试剂盒为江苏硕世生物科技有限公司生产，两种试剂均采用一步法RT-PCR技术，所有试剂均在有效期内使用。

1.3主要仪器荧光PCR仪为ABI公司7500型。

1.4检测方法病毒RNA提取、双重实时荧光PCR和单一实时荧光PCR、扩增产物分析方法均按试剂盒及仪器操作说明书进行。检测策略是先用单一实时荧光PCR对疑似手足口病标本中肠道病毒通用病毒核酸进行检测,肠道病毒通用病毒核酸阳性标本再用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸，比较两种方法检测结果。

2结果

240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份，阳性率为65.42%。157份阳性标本经两种方法分型，结果双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份，EV71阳性1份,其他肠道病毒45份，单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份，EV71阳性1份，CoxA16+EV71阳性2份，其他肠道病毒45份。见表1

表1157份阳性标本分型情况

3讨论

实时荧光PCR技术是在传统RT-PCR的方法上进行改良的方法，采用特异性标记的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA起始浓度进行定量或定性的方法,并且灵敏度高，特异性强，该检测方法的反应和分析在完全闭管的条件下进行，能有效防止PCR产物的污染，提高检测结果的可靠性；试剂在PCR检测仪上进行扩增和分析，无需电泳和紫外灯观测等步骤；从标本处理开始只需要3～4h即可完成检测，节省了检测时间[2]。这些优点在过去一年的实际运用中已发挥很大作用，给多起手足口病的疫情处理、临床诊断治疗提供了及时准确可靠的实验数据，大大提高了检测的实效性。

单一实时荧光PCR和双重实时荧光PCR的区别在于PCR反应体系里引物对数多少不同，单一实时荧光PCR是应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，用于单一致病因子等的鉴定。双重实时荧光PCR它是在同一PCR反应体系里加上二对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般实时荧光PCR相同。且具有高效、系统性以及经济简便等优点，大大提高了检测的实效性。本研究应用的双重实时荧光PCR检测手足口病毒核酸就是在同一PCR反应体系里加上CoxA16和EV71二对特异性引物，经PCR扩增后，同时检测CoxA16和EV71特异性核酸，检测全过程所需时间与单一实时荧光PCR相当，从标本处理开始3～4h即可完成检测。表1检测结果显示，两种方法检出的符合率都很高，其中EV71和其他肠道病毒的检出符合率达100%，表明两种方法的特异性和灵敏度相当。CoxA16的检出结果误差2例，提示使用不同厂家的试剂，它们的特异性、敏感性也存在一定的差异。

从几个月的应用体会到，双重实时荧光PCR较单一实时荧光PCR节省耗材，缩短配体系、加样时间，又能同时对CoxA16和EV71进行快速检测，并且灵敏度高特异性好，在疫情暴发时，能提高检测速度和准确性，适合于手足口病病毒快速检测。

虽然实时荧光PCR法优点很多，但所需要的仪器设备昂贵，检测试剂成本也高，对于基层医疗机构来说难以推广使用，因此今后需要进一步完善手足口病原体检测技术，特别是快速、准确、操作简单、成本低廉的检测技术。

参考文献

[1]李兰娟.手足口病[Ｍ].杭州：浙江科学技术出版.2008.1－5.

[2]田燕.陆志刚.梁洁.手足口病检测方法的研究进展[J]．现代预防医学,2011（38）15:3058-3059，3064.