Rho／ROCK信号通路在腹膜透析大鼠腹膜纤维化中的作用及法舒地尔的干预效应

Rho／ROCK信号通路在腹膜透析大鼠腹膜纤维化中的作用及法舒地尔的干预效应

孟绪初1甘平2（通讯作者）

孟绪初1甘平2（通讯作者）

（1贵州医科大学研究生学院贵州贵阳550004）

（2贵州医科大学附属乌当医院肾内科贵州贵阳550018）

【摘要】目的：探讨Rho／ROCK信号通路在腹膜透析大鼠腹膜纤维化中的可能机制。方法:将30只雄性SD大鼠随机分为四组：对照组，每日腹腔注射生理盐水25ml；模型组，每日腹腔注射4.25%的腹透液25ml；Fasudil组，每日腹腔注射含法舒地尔(Fasudil)浓度为10mg/Kg?d的4.25%腹透液25ml。实验第28天，取壁层腹膜组织行HE染色，并测定壁层腹膜ROCK-1的表达情况及SOD、MDA含量。结果：与模型组比较，Fasudil组不同程度腹膜厚度减少、胶原纤维沉积减轻，腹膜组织ROCK-1表达减少(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性增加(P<0.05)。结论：腹膜透析液激活了腹膜透析大鼠腹膜Rho／ROCK信号通路，促进腹膜组织氧化应激损伤，导致了腹膜纤维化的发生，ROCK抑制剂法舒地尔能通过抑制此通路减少腹膜的氧化应激反应，进而延缓腹膜纤维化进展。

【关键词】腹膜透析；腹膜纤维化；氧化应激；Rho／ROCK信号通路

【中图分类号】R459.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）08-0059-03

Rho/ROCKsignalingpathwayinpdratperitonealfibrosis,theeffectoftheinterventioneffectofshu,andthemethod

MengXuchu1GanPing2.1GuizhouGuiZhouGuiYangmedicalUniversitygraduateschoolof550004,China.2WuwhenHospitalaffiliatedtomedicalUniversityrenalmedicineinguizhouGuiZhouGuiYang550018,China

【Abstract】ObjectiveTostudytheRho/ROCKsignalingpathwayinthepossiblemechanismofpdratperitonealfibrosis.Methods30maleSDratswererandomlypidedintofourgroups:controlgroup,thedailyintraperitonealinjectionofsaline25ml;Modelgroup,thedailyintraperitonealinjectionof4.25%oftheliquidtodrain25ml;ByintraperitonealinjectionofFasudilgroup,dailywithshutofarmar(Fasudil)concentrationof10mg/Kg,4.25%ofthedtodrainfluid25ml.Experiment28days,parietallayerandorganizationallineHEstaining,andthedeterminationofparietallayerandtheexpressionofROCK-1andSOD,MDAcontent.ResultsComparedwithmodelgroup,differentFasudilgroupperitonealthicknessreduce,collagenfibersdepositionreduction,reducedperitonealorganizationROCK-1expression(P<0.05),lowerMDAcontentincreased(P<0.05),SODactivity(P<0.05).ConclusionPeritonealdialysateactivatesthepdratperitonealRho/ROCKsignalingpathway,promotetheperitonealtissuesoxidativestressdamage,causedtheincidenceofperitonealfibrosis,shutofarmarROCKinhibitorscaninhibitthepathwaytoreduceperitonealoxidativestressresponse,anddelaytheprogressofperitonealfibrosis.

【Keywords】Peritonealdialysis;Peritonealfibrosis;Oxidativestress;Rho/ROCKsignalingpathway

腹膜透析（PD）是终末期肾脏疾病的主要替代治疗方法之一。然而随着PD治疗时间的延长常常伴发腹膜纤维化，其所致的超滤衰竭是维持性腹膜透析患者退出治疗的主要原因[1-2]。目前认为腹膜透析液的生物不相容性是导致腹膜纤维化的最主要因素。许多研究表明，葡萄糖腹膜透析液诱导了腹腔及腹膜组织的高氧化应激状态，促进腹膜增厚、超滤失败等的发生，并最终导致腹膜纤维化[3]。近年来随着Rho/ROCK通路研究的不断深入，大量研究已证实Rho/ROCK信号途径参与许多纤维化、硬化性疾病,如ROCK抑制剂能抑制肝脏、肺、肾脏纤维化[4-5]。但该通路在腹膜纤维化中的作用报道甚少，本实验同过建立高糖诱导大鼠腹膜纤维化模型，观察ROCK抑制剂法舒地尔对腹膜透析大鼠腹膜组织学变化、氧化应激相关指标的影响，探讨Rho／ROCK信号通路在腹膜透析大鼠腹膜纤维化中的可能机制，并为临床防治提供实验依据。

1.材料与方法

1.1实验动物及分组

周龄相同（10周龄）、体重相近（250±30g克）雄性清洁级SD大鼠30只（第三军医大学动物中心提供）。随机分为3组，每组10只：对照组，每只大鼠每天一次腹腔注射生理盐水25ml；PDS组，每只大鼠每天一次注射4.25%的腹透液25ml；Fasudil组，每日腹腔注射含法舒地尔10mg/Kg?d的4.25%腹透液25ml。LPS用4.25％腹透液稀释为6mg/L,除对照组外，其余各组大鼠在第8、10、12、22、24、26天按0.6mg/kg腹腔注射LPS。于实验第28天处死动物取腹膜组织待检。

1.2药物、主要试剂和仪器

盐酸法舒地尔注射液(天津红日药业有限公司)、4.25%葡萄糖透析液（美国百特公司）、ROCK-1(一抗，武汉博士德公司)、光学显微镜（德国Zeiss，LSM-510）。

1.3腹膜组织形态学观察

取石蜡包埋的壁层腹膜组织，作2μm切片，60℃烘干融蜡，然后以二甲苯脱蜡,乙醇梯度复水,常规方法HE染色，光镜下观察病理改变。

1.4检测指标

采用即用型（Envision）二步法免疫组化检测大鼠腹膜组织ROCK-1的表达，使用Image-ProPlus6.0图像分析系统对结果进行分析，阳性强度量化为平均光密度值(MeanDensity)。取大鼠壁层腹膜制成组织匀浆，按试剂盒说明以WST-1法测SOD活力，硫代巴比妥酸法测MDA含量。

1.5统计学处理

采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1各组大鼠壁层腹膜组织病理学改变

光学显微镜下观察，对照组腹膜较薄，间皮细胞完好，胶原纤维无明显沉积。模型组大鼠腹膜明显增厚，间皮细胞脱落，胶原纤维大量沉积。Fasudil组大鼠腹膜纤维化程度介于对照组和模型组之间（见图2-1）。

对照组模型组Fasudil组

图2-1各组大鼠腹膜组织HE染色结果（×400）

2.2免疫组化

细胞浆中呈棕黄色染色颗粒者为ROCK-1阳性表达。与对照组相比，模型组大鼠腹膜组织中ROCK-1表达明显升高（0.36±0.008比0.11±0.003，P<0.05）；Fasudil治疗组较模型组表达下降（0.27±0.007比0.36±0.008，P<0.05），与对照组比较仍较高（0.27±0.007比0.11±0.003，P<0.05）。（见图2-2-1）

正常组对照组Fasudil组

图2-2-1各组大鼠ROCK-1免疫组化彩色图像（×400）

2.3各组腹膜组织氧化指标检测结果

模型组腹膜组织的SOD活力显著低于对照组(P<0.05)；Fasudil组SOD活力显著高于模型组(P<0.05)，但仍低于对照组(P<0.05)。模型组、治疗组MDA含量较对照组升高(P<0.01)，治疗组与模型组相比较，MDA含量显著低于模型组(P<0．05)。（见表）

表各组大鼠腹膜组织中氧化应激指标SOD活性与MDA含量的比较（x-±s）

注：aP<0.05vs对照组；bP<0.05vs模型组；

3.讨论

腹膜透析（PD）作为终末期肾病一体化疗法的一个重要组成部分，因其具有残余肾功能保护较好等优点，在临床上得到了广泛的应用。然而，长期腹膜透析患者因腹膜透析液的生物不相容性、透析相关性腹膜炎、全身微炎症状态等因素而发生腹膜纤维化[6]，最终导致腹膜超滤衰竭，因而很大程度地限制了该方法的应用。在众多致腹膜纤维化因素中，尤以非生物相容性腹膜透析液长期使用最为重要[7]。Dobbie[8-11]认为，高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞损伤是腹膜纤维化的始动因素，一旦间皮细胞受损，即分泌细胞外基质以及多种致纤维化因子，这些因子的过度表达干扰了细胞外基质的正常代谢，促使其过度沉积，最终导致腹膜纤维化的发生[12-13]。

研究表明,腹膜透析患者普遍存在氧化应激，氧化应激是高糖损伤腹膜间皮细胞的重要机制。Noh等[14]通过使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可防止高糖PD液引起的腹膜增厚和转运功能的变化。近年来研究表明Rho/ROCK信号通路参与了肿瘤性、神经性、纤维化及心血管等多种疾病的发生、发展,成为研究的热点。Rho蛋白主要成员有RhoA、RhoB、RhoC等，其中最重要的是RhoA[15]。Rho蛋白以2种形式存在：Rho与GTP结合时为激活状态，与GDP结合时为失活状态，通过在这两种状态中交替变化，RhoGTP酶发挥分子开关的作用[16]。在与GTP结合状态下，RhoA同很多效应器分子结合，促进一系列信号级联反应，发挥生物学效应。Rho激酶(ROCK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够与GTP-Rho相结合形成RhoA/ROCK通路，是目前功能研究最为详细的Rho下游靶效应分子。ROCK由两种同源性极高的异构体组成：ROCK1和ROCK2。肾脏组织中主要以ROCK-1形式存在。Rho/ROCK通路通过控制肌动蛋白细胞骨架的装配调节细胞的收缩、黏附、迁移、增殖和凋亡。目前大量研究已证实Rho/ROCK通路通过参与许多纤维化、硬化性疾病，如ROCK抑制剂能抑制肝脏、肺、肾脏纤维化。最近一些研究还表明，氧化应激与Rho/ROCK通路激活具有相关性，糖尿病肾病的研究证实，ＲOCK抑制剂是通过抗氧化作用抑制糖尿病肾纤维化[17]。法舒地尔（Fasudil）是目前在临床中最常用的ROCK抑制剂，它通过与ATP竞争ROCK催化区的ATP结合位点，而抑制ROCK的活性发挥药理作用[18]。

本实验显示：模型组大鼠腹膜可见明显间皮细胞脱落、坏死，间皮下基质明显增厚，胶原纤维大量沉积，腹膜厚度显著增加，提示腹膜纤维化模型造模成功，也论证上述高糖腹膜透析液可诱导腹膜纤维化的发生。与正常对照组相比，模型组大鼠腹膜组织中ROCK-1表达增加，抗自由基作用的酶SOD活力减少，脂质过氧化产物MDA含量增加（P<0.05）。经特异性ROCK抑制剂法舒地尔治疗干预后，大鼠腹膜纤维化程度明显减轻，与高糖模型组相比，ROCK-1表达显著下降，MDA含量显著降低，SOD活力显著升高。

综上所述，高糖腹透液激活了大鼠腹膜Rho/ROCK信号通路，促进腹膜组织氧化应激反应，导致了腹膜纤维化的发生，氧化应激是腹膜纤维化发生发展的重要机制之一。ROCK抑制剂法舒地尔对腹膜纤维化有延缓作用，其机制可能与抑制Rho/ROCK信号通路，减少ROS生成，从而减轻腹膜氧化损伤，改善腹膜纤维化。Rho/ROCK信号通路有可能成为防治腹膜纤维化的新靶点。

【参考文献】

[1]DevuystO，MargettsPJ，TopleyN．Thepathophysiologyoftheperitonealmembrane．JAmSocNephrol，2010，21：1077—1085．

[2]范汝艳，翁宁，徐佳美等．持续性非卧床腹膜透析患者退出原因分析．中国中西医结合肾病杂志，2008，9：708．709．

[3]NohH,KimJS,HanKH,etal.Oxidativestressduringperitonealdialysis:implicationsinfunctionalandstructuralchangesinthemembrane[J].KidneyInt,2006,69(11):2022-2028.

[4]MurataT,AriiS,NakamuraT,eta.lInhibitoryefectofY-27632,aROCKinhibitor,onprogressionofratliverfibrosisinassociationwithinactivationofhepaticstellatecells[J].JHepatol,2001,35:474-481.

[5]ShimizuY,DobashiK,IizukaK,eta.lContributionofsmallGTPaseRhoanditstargetproteinrockinamurinemodeloflungfibrosis[J].AmJRespirCritCareMed,2001,163:210-217.

[6]KyudenY，ItoT，MasakiT，eta1．Tgf-betalinducedbyhighglucoseiscontrolledbyangiotensin-convertingenzymeinhibitorandangiotensinⅡreceptorblockeronculturedhumanpetitonealmesothelialceUs．PetitDialInt，2005，25：483．491．

[7]TominoY．Mechanismsandinterventionsinperitonealfibrosis．ClinExpNephrol，2012，16(1):109-114．

[8]LindenT,MusiB,JarkelidK,etal.Glucosedegradationproductsinperi-tonealdialysisfluidsmayhavebothlocalandsystemiceffects:astudyofresidualfluidandmesothelialcells.PeritDialInt,2001,21(6):607-10.

[9]JanuszW,JustynaW,KatarzynaK,etal.ProlongedExposuretoGlucoseDegradationProductsImpairsViabilityandFunctionofHumanPeritonealMesothelialCells.JAmSocNephrol,2001,12:2434-2441.

[10]AyoSH.Highglucosecausesanincreaseinextracellularmatrixproteinsinculturedmesangialcell.AmJPathol,1990,136:1339-1348.

[11]DobbieJW．Pathogenesisofperitonealfibrosingsyndromes(sclerosingperitonitis)inperitonealdialysis．PeritDialInt，1992，12(1):14－27．

[12]WagnerF,AsfarP,CalziaE,etal.Bench-to-bedsidereview:Hydrogensulfide-thethirdgaseoustransmitter:applicationsforcriticalcare[J].CritCare,2009,13:213.

[13]刘映红,刘伏友,张浩等.高糖对人腹膜间皮细胞的增殖和损伤及分泌细胞因子的影响[J].中南大学学报(医学版),2006,31:575-579.

[14]NohH,KimJS,HanKH,etal.Oxidativestressduringperitonealdialysis:implicationsinfunctionalandstructuralchangesinthemembrane[J].KidneyInt,2006,69(11):2022-2028.

[15]JaffeAB,HallA.RhoGTPases:Biochemistryandbiology.AnnuRevCellDevBiol2005;21:247-69.

[16]LiaoJK，SetoM，NomaK．Rhokinase(ROCK)inhibitors［J］．JCardiovascPharmacol，2007，50(1):17-24.

[17]GoJOA，UtsunomiyaK，TaniguchiK，etal．TheRho-kinaseinhibitor，fasudil，attenuatesdiabeticnephropathyinstreptozotocin-induceddiabeticrats［J］．EurJPharmacol，2007，568:242-247．

[18]YambeT,YoshizawaM,SaijoY,etal.Brachio-anklepulsewavevelocityandcardio-anklevascularindex(CAVI)[J].

BiomedPharmacother,2004,58(Suppl1):S95-98.