大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性研究方法概括

大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性研究方法概括

陈焕文

陈焕文（上海市普陀区中心医院药剂科201203）

【摘要】目的：综述大鼠肝微粒体中细胞色素CYP450活性研究方法。方法：查阅国内外文献，对肝微粒体CYP450进行介绍，并总结和归纳中药在CYP450酶活性研究方法的应用。结果：CYP450研究方法主要包括体外实验：CO吹泡法，化学显色法，体外温孵和体内cocktail探针实验。该方法的应用从中药单体成分逐渐发展到中药提取物、中药复方。结论：随着科研水平的提高，体外方法对CYP450研究越来越深入，合体内cocktail探针法，提高药物体内代谢清除预测的准确性。

【关键词】中药P450酶肝微粒体温孵cocktail探针

中药，具多成分的特点,每一味中药均含有大量的化学成分，在中医药理论指导下，遵循整体辩证论治的原则进行研究及治疗。近十几年来，中药在细胞色素P450方面的应用越来越广泛和深入，不仅仅局限于单体对P450酶活性的影响，后还有单味药作为研究对象，发展到现在，中药复方对P450酶的研究越来越受到海内外学者的关注。体现了中药不仅局限于传统的应用技术上，还不断的融合于新技术、新思维、及新的领域，为更进一步的了解中药多成分，多靶点，多效应的理论基础开创新的依据。

一、细胞色素P450酶的简介

细胞色素P450酶是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和内源性的物质代谢中起着极其重要的作用，并引起自身或其他药动学的改变，使得药效增强或减弱，而导致药物中毒或无效，药物-药物相互作用的结果，药物对P450酶系活性的影响是药物代谢相互作用最重要的机制。药物代谢酶分Ⅰ相和Ⅱ相,细胞色素P450酶(以下简称CYP450或P450)是Ⅰ相催化多种药物、前毒物、前致癌物等外源性物质的氧化和还原代谢的主要酶类，细胞色素P450是由多种同功酶组成的超大“家族”,与外源性化合物代谢作用有关的约30多种,主要由CYP1、CYP2和CYP3三个族组成,其中CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6，CYP2E1和CYP3A4是最主要的6种亚型,含量约占肝内CYP450酶总量的80%以上,且90%以上的上市药物是由这6种亚型代谢的[1-3]。表1阐述了在肝脏中CYP亚型酶个体的相对比例，列举包括底物、抑制剂和诱导剂。众所周知，CYP亚型酶能代谢大多数在结构上有差异的外源性物质，还有很多综述均作了详细的报道[4-7]。

表1肝脏中各CYP450亚型的相对含量百分比，探针底物，抑制剂及诱导剂

二、P450酶活性方法研究

查阅近十年来国内外文献，考察中药对P450酶活性的方法大致归为2类：体外和体内研究方法。

2.1体外研究方法

肝药代谢酶检测方法中最常用的是肝微粒体法，此法制备简单，代谢时间短，易于重现，方便大量操作。检测肝微粒体P450酶活性的体外研究方法，大致归为3类：CO吹泡法，化学比色法，体外温孵法。无论采用哪种方法，测蛋白含量是基础和必需的，目前常用测蛋白含量的方法有微量凯氏定氮法，Lowry法[8]及考马斯亮蓝染色法[9]。

2.1.1CO吹泡法[10]

基本原理：在还原状态下的细胞色素P450可与一氧化碳结合，形成复合物，在波长450nm处出现最大吸收峰，根据峰高测定值的大小计算P450酶的含量。将待测药物对大鼠灌胃数日，后取其肝脏制备肝微粒体，测定蛋白浓度及P450酶含量。该方法是测定P450酶含量最经典的方法，国内大部分学者均是通过测药物对P450酶含量的影响来反映酶活性，因为P450酶活性及其催化能力由酶含量决定，而且此种测酶活性的方法操作简便，指标明确，检测手段多为紫外分光光度仪，条件易满足。如：赵润英等[11]，研究肉豆蔻挥发油对肝脏微粒体细胞色素P450（CYP）、细胞色素B5（Cytb5）、丙二醛（MDA）和血清谷胱甘肽转移酶（GST）的含量；胡锡琴，林飞等[12]研究何首乌、制何首乌以及分别配伍不同剂量茯苓对大鼠肝脏微粒体细胞色素P450酶(CYP450)的影响；韦炳华,宗连柱等[13]研究复方丹参滴丸对大鼠肝微粒体细胞色素P450含量的影响；Kishida,T.;Ataki,H.等[14]研究曲霉发酵过的黄豆粉对大鼠肝微粒体P450酶含量的影响。同样的测酶含量变化来反映酶活性的有葛根素，枳覆子乙酸乙酯提取物，大黄蒽醌衍生物，人参、藜芦等[15-18]；由此可知，测酶含量的方法不仅适用于单体，提取物，同时对复方的应用亦逐渐尝试，由于酶含量测量指标与药物的成分复杂程度并无直接关系，但不能直接反映药物对具体的亚型酶的活性影响，而仅仅是总P450酶的活性。

2.1.2化学比色法

基本原理：二甲基亚硝胺主要经细胞色素P4502E1的催化，先进行碳位的羟化，继而甲醇胺中间产物分解，释放出甲醛，通过Nash比色法以测定甲醛生产量的多少来反应P4502E1的活性。如侯佩玲等[20]研究菊花提取物对大鼠肝微粒体细胞色素P450的影响，研究表明菊花提取物降低二甲基亚硝胺脱甲基酶活性，即抑制P4502E1活性。红霉素脱甲基酶和氨基比林脱甲基酶活性测定原理同二甲基亚硝胺脱甲基酶活性测定，此酶分别主要反应P4503A和P4502家族的活性,Nash比色法对其两种亚型酶活性的测定是最常见的应用，如黄果等[21]采用Nash显色法测定黄连与吴茱萸单、合用对大鼠肝微粒体中P4503A和P4502C酶活性，结果推测黄连吴茱萸药对配伍抑制CYP450酶系中的CYP2和CYP3A活性,对黄连主要有效成分盐酸小檗碱肝脏代谢产生抑制作用；吴笑春等[22]研究盐酸小檗碱与环孢素A合用对小鼠肝药代谢酶的影响，测定红霉素脱甲基酶和氨基比林脱甲基酶活性，结果表明盐酸小檗碱与环孢素A合用较各自单用对P450抑制作用强；另外，7-乙氧基或戊氧基香豆素在细胞色素P450同工酶的催化下，7位乙氧基或戊氧基发生脱羟反应，生成香豆素。其中7-乙氧基是P4501A,戊氧基香豆素是P4502B的相对特异性底物。Nash比色法较CO吹泡法对P450酶活性研究具体，可针对到少许具体亚型酶活性的影响，如P4502E1,3A,但氨基比林脱甲基酶反映P4502家族总酶活性，却不能具体到2C9,2C19,2D6等各亚型酶活性，仍是有所不足。

2.1.3体外温孵法

基本原理：肝微粒体体外温孵法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理环境条件下进行生化反应的体系。此方法是将待考察的药物，直接与探针底物共同孵育，测定探针底物的代谢情况，判断药物对相应酶活性的影响，更适合于测药物对不同P450亚型酶的活性影响，且可以通过底物的代谢动力学反映酶活性影响的大小。如：曹亚杰,曹伟等[23]研究吴茱萸次碱在人肝微粒体中对细胞色素P450酶的抑制作用；用代谢产物与母药比值来表达酶的活性，结果：吴茱萸次碱对CYP1A2，CYP2C19，CYP2E1和CYP2D6的活性有显著抑制作用，而对CYP2C9和CYP3A4的活性无显著影响；毕惠嫦，和凡等[24]研究丹参酮ⅡA在大鼠肝微粒体酶中的代谢动力学，采用高效液相-质谱联用方法测定孵育液中丹参酮ⅡA原形药物的浓度，研究丹参酮ⅡA的酶促动力学，推导出药物米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)；并计算体外酶对药物的清除率(CLint)，同时观察不同浓度和不同种类的CYP酶特异性抑制剂对丹参酮ⅡA代谢的影响。体外给药，体外孵育法对孵育药物的要求高，故多为单体作为孵育对象进行研究。近年来随着研究领域的不断拓展和创新，提取物进行孵育也屡见不鲜，如：眭维国，晏强等[25]研究柚子提取物对小鼠肝微粒体代谢活性的影响，在体外小鼠肝微粒体孵育体系中加入睾丸酮和不同柚子提取物后,以高效液相色谱法测定6β-羟基睾丸酮的生成量。Chatterjee,P.；Franklin,M.R.[26]研究北美黄连提取物对人细胞色素P450的抑制作用。由浅入深，对复方的应用也逐渐发展，如：翁小刚，李玉洁等[27]研究戊己丸不同配比方对大鼠体外CYP1A2酶活性的影响，戊己丸与CYPIA2特征底物一非那西丁共同孵育，HPLC进样测定非那西丁代谢产物-对乙酰氨基酚浓度，对乙酰氨基酚的生成量与CYP1A2酶活性呈正相关，从而得到对酶活性的影响，结果：戊己丸不同配比方对CYP1A2的抑制影响存在较大差异；夏春华等[28]运用体外温孵法研究生脉饮注射剂对CYP4503A1/2，2C6，1A2，和2E1亚型酶的活性影响，结果表明生脉饮注射剂对CYP4503A1/2，2C6有抑制作用，而对1A2，和2E1抑制作用不够明显。除此之外，还有血塞通注射液、灯盏细辛注射液等进行研究[29-30]。与以上两种酶活性测定方法比较，此法对P450亚型酶研究更具体，针对性更强。目前肝微粒体体外温孵法被越来越多地用来预测药物在体内的代谢清除，一般通过测定药物体外代谢酶促动力学获得Vmax及Km(米氏常数)，运用合理的药动学模型来推断体内药物的代谢清除。

2.2体内试验

CYP450体内研究是在实验动物或人体整体用药的基础上进行的,可以直观、准确地反映有生命机体在生理状态下的药物代谢状况,但易受个体机能状态、个体差异等因素的影响。在体内实验中，可根据待研究CYP450探针药物的血药浓度、AUC,tl/2等药动学参数间接反应CYP450对某药的代谢情况,以及测定探针药的代谢产物生成量来反映机体CYP450酶的活性,还可以用特异的诱导剂或抑制剂判断CYP450同工酶在所研究底物代谢中的作用。如：奚丽君，陈卫平等[31]应用探针药物法评价半夏生姜配伍对细胞色素P450酶的影响，尾静脉注射探针药物,于给药后眼眶取静脉血,经提取、处理后,通过高效液相色谱法检测探针药物的药物浓度。闫淑莲,扈金萍等[32]采用Cocktail探针药物同时评价连翘对肝细胞色素P450的影响，于大鼠的右侧颈静脉处做插管手术，注射探针药物，眼眶取血，处理并分析各组CYP450酶系的活性；胡道德，顾磊等[33]Cocktail探针药物评价淫羊藿提取物对大鼠CYP450酶的影响，灌胃给予探针药物，采用RP-HPLC法检测各探针药物浓度，通过药动学参数来评价各组CYP450酶系的活性。魏玉辉,秦红岩等[34]研究六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶P450活性的影响，大鼠灌胃分别给予生理盐水、西咪替丁、苯巴比妥钠和六味地黄丸7d后,腹腔注射非那西丁,不同时间点采集血样,用HPLC法测定血浆中探针药物非那西丁的浓度,用DAS软件估算其药动学参数，结果：六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶P450活性有一定的诱导作用。由此可知，通过体内试验测CYP450酶活性，不仅是单体还是提取物及复方均发展很成熟，对探针药物的血药浓度检测也不复杂，为后续药物体内外相结合的研究奠定了基础。

三、讨论与展望

综观目前的研究现状，已进行研究的中药品种还不多，而作为中药主导使用形式的中药复方对CYP450影响的研究更少；同时，可能限于科研水平和科研资金,国内的研究大部分仅限于对CYP450总含量的测定。对酶活性研究最多的数体外温孵法，但其主要是应用在单体成分上较广泛，其次是体内试验。随着实验手段的不断更新，临床前应用cocktail体外探针人肝微粒体孵育试验,结合LC/MS快速梯度洗脱分析技术或荧光分析技术,能高通量地获取植物药成分对人肝CYP活性的影响，为筛选出药理活性高又不易引起临床代谢性相互作用的新化合物奠定了坚实的基础。

通过体内外肝脏试验的联合研究，可在药物开发初期就剔除掉首过代谢强的药物，且药物在人体内肝脏代谢清除率的体外预测已经日趋成熟，体外模型也相对简单，这样既可减少体内实验的次数，又能加快药物开发的步伐。但预测过程中仍然存在一些问题：如何解决由种属差异或者体外模型的非生理特性导致的预测准确性的降低，以及药物的蛋白结合等。相信随着研究的进一步深入，肝脏代谢清除率的体外预测将在药物开发初期发挥更加重要的作用，从而进一步缩短药物开发的周期，提高药物进入临床应用的成功率。

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