牛黄上清丸细菌、霉菌及酵母菌计数的验证方法统一的研究

牛黄上清丸细菌、霉菌及酵母菌计数的验证方法统一的研究

张亚茹

张亚茹(阜新市药品检验所辽宁阜新123000)

【中图分类号】R284【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2013）09-0389-03

【摘要】目的确定严谨的最佳的统一的牛黄上清丸细菌、霉菌及酵母菌的验证方法。方法《中国药典》2010年版一部附录XⅢC微生物限度检查法。结果最终确定牛黄上清丸细菌、霉菌及酵母菌计数的验证方法，细菌计数可采用培养基稀释法（5倍稀释），霉菌及酵母菌计数可采用常规法。结论通过对8家生产企业的牛黄上清丸细菌、霉菌及酵母菌计数验证方法的整理，筛选，实验，最后确定科学、严谨的统一的验证方法，即方便了检验，也避免了资源的浪费，使牛黄上清丸细菌、霉菌及酵母菌计数方法得到了合理的统一。

1、样品来源及生产单位提供的验证方法统计表

名称：牛黄上清丸

2、实验用品

2.1验证用菌种

大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]

以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。

2.2培养基

改良马丁培养基批号100510改良马丁琼脂培养基批号081126

营养琼脂培养基批号101109玫瑰红钠琼脂培养基批号110224pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液批号101103

以上培养基厂家都是北京三药科技开发公司，质量均经过质量评估。

2.3仪器设备

电热恒温培养箱：型号DNP-9272霉菌培养箱：型号MJP-150手提式高压蒸汽消毒器：型号YXQ.SG46.280

电子天平：型号FE20K

3、验证方法

3.1验证依据

《中国药典》2010年版一部附录XⅢC

3.2菌液制备

3.2.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（白色念珠菌）的新鲜培养物至营养琼脂（改良马丁琼脂）培养基上，35℃（25℃）培养24（48）小时，取培养物适量加入到0.9%无菌氯化钠溶液中，与标准比浊液浊度相当，作为原液，取原液倍量稀释至细菌数约为50～100cfu/ml，备用。

3.2.2接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面上，25℃培养7天，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含孢子数约为50～100cfu/ml孢子悬液，备用。

3.3供试液制备

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使溶解，作为1：10的供试液，备用。

3.4菌落计数方法

3.4.1常规法

取1：10供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入同一平皿中，立即倾注培养基。按平皿法测定其菌落数。

3.4.2培养基稀释法

取1：10供试液1ml分别注入5个平皿中，同时加入50～100cfu试验菌，立即倾注培养基。按平皿法测定其菌落数。

3.5回收率测定

试验分4组，进行三次独立的平行试验，分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。

3.5.1供试品组

取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50～100cfu试验菌，按菌落计数方法进行落计数。

3.5.2活菌组

取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。

3.5.3供试品对照组

取最低稀释级的供试液（1：10）1ml，测定供试品本底菌数。

3.5.4稀释剂对照组

取稀释剂1ml和50～100cfu试验菌，按供试品组菌数测定方法测定其菌数。

4、结果及结论

4.1结果

菌落计数及回收率测定结果见表1-5。结果表明，采用常规法验证，在三次独立的平行试验中，除2个厂家枯草芽孢杆菌的试验组菌回收率均低于70%；其余试验组及稀释剂对照组的菌回收率高于70%。枯草芽孢杆菌检查方法应采用消除供试液抑菌活性的方法重新进行验证。采用培养基稀释法（5倍稀释法）重新验证后，枯草芽孢杆菌的试验组及稀释剂对照组的菌回收率高于70%。

4.2结论

根据验证试验结果确定细菌计数可采用培养基稀释法（5倍稀释法）、霉菌及酵母菌计数可采用常规法。

表1A

表2B

表3C

表4D

表5E

5.小结

方法学验证，是对整个检查方法的完善，可使检验结果更真实可靠。微生物限度检查方法学验证是2005年版《中国药典》的新增内容，药典对此作了相关规定，但由于验证过程及方法的特殊性，许多生产厂家验证方法做的不到位也不规范，同一品种的方法各异，漏洞百出，给检验造成了困扰。所以确定科学合理的验证方法是至关重要的。