间接ELISA法检测油菜花粉过敏原方法的建立

间接ELISA法检测油菜花粉过敏原方法的建立

王楠

王楠

盐城卫生职业技术学院基础医学部江苏盐城224005

摘要：目的利用油菜花粉过敏原粗提液建立间接ELISA检测方法。方法油菜花粉过敏原粗提液为抗原包被酶标板，通过对间接ELISA各反应条件的优化，确定了最佳反应条件。结果油菜花粉过敏原浓度稀释度为1：200（即浓度为10ug/ml），血清血清稀释度为1：100。采用已建立的间接ELISA反应条件，对10份阴性血清的检测结果进行统计学分析，确定间接ELISA的判定标准，D450值大于等于0.254为阳性。本试验建立的间接ELISA检测法敏感度为89.7%。

Abstract：ObjectivesToestablishanELISAtechniquetodetectoilseedrapepollenallergen.MethodsAnindirectELISAtechniquewasdevelopedusingoilseedrapepollenallergenasacaptureantigen.ByoptimizingthereactionconditionsforeachindirectELISA，wedeterminetheoptimalreactionconditions.ResultsWithoilseedrapepollenallergenasacaptureantigen，theproperdilutionofcoatingantigenwas1：200andtheproperdilutionofserumwas1：100.Thecut-offvalueoftheassaywasdeterminedbystatisticsanalysisbasedon10negativesamples，withODequaltoorhigherthan0.254beingconsideredpositive.ThetestestablishedindirectELISAassaysensitivitywas89.7%.

前沿

花粉过敏是由花粉引发的过敏性疾病，可引发鼻粘膜、眼结膜、支气管，甚至哮喘的发生。油菜是我国大面积种植的农业经济作物，粉源广，花期长，是我国春季主要花粉之一。有研究表明目前对花粉过敏的患者中有7.1%的患者对油菜花粉过敏[1]。油菜花粉过敏的准确诊断，能有效的控制油菜花粉过敏的发生。因此，建立一种低成本，且具有较高特异性的油菜花粉过敏的诊断方法，具有重要的意义。故而，本实验以油菜花粉过敏原粗提液为抗原建立间接ELISA方法，用于对油菜花粉过敏的诊断。

材料与方法

1.材料

1.1实验仪器与试剂油菜花粉采自江苏盐城市郊，辣根过氧化物酶标记抗人IgE抗体（anti-humanIgE/HRP）为美国Sigma公司产品，TMB显色液、牛血清白蛋白等试剂均为国产试剂。iMark酶标仪，美国Bio-Rad公司。

1.2血清待测阳性血清采自本市各医院诊治的39例哮喘患者，其中男性20例、女性19例，年龄3~52岁，平均（29.5±15.0）。患者的入选标准[2]：用油菜花粉粗提浸液进行皮肤点刺试验（SPT）阳性，风团直径≥3mm，无花粉特异性免疫治疗史。阳性参考混合血清为油菜花粉粗提浸液SPT试验（风团直径≥5mm）的5位患者，阴性参考血清为母亲无遗传过敏史脐带血清10份。

2.方法

2.1油菜花粉过敏原粗提液油菜花粉过敏原的提取参照参考文献[3]的方法，用Bradford法测定过敏原总蛋白量。

2.2抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定按照方阵滴定法，用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液将油菜花粉过敏原抗原包被液稀释，稀释度1：800、1：200和1：50，纵向包被酶标板，200ul/孔适当稀释的油菜花粉过敏原，水浴37℃2h，用PBS洗涤液（含20%的Tween20）洗涤5次，每次5min；每孔加入200ul含有3%BSA封闭液，4℃封闭过夜；涤液（方法同上）；每孔加入200ul稀释血清，血清稀释度分别1：200、1：100和1：50，水浴37℃2h，涤液（方法同上）；加入100ul/孔anti-humanIgE/HRP，稀释度为1：1000，水浴37℃2h，涤液（方法同上）；加入100ul/孔TMB显色液，水浴37℃30min；加入100ul/孔2mol/l硫酸终止液；在450nm处，用酶标仪检测实验结果，实验均设置3个附孔。

2.3间接ELISA阴性和阳性临界值的确定按上述建立的间接ELISA方法，对10份阴性血清进行检测。每份样品重复4孔，结果取其平均值，计算样本的D450平均值和标准方差（SD）。阳性临界值=阴性D450平均值+3*SD，当样品D450值大于等于阳性临界值即判定为阳性，小于此值为阴性。

2.4敏感性试验对39份阳性血清进行100倍稀释后进行检测，同时设置1个空白孔，2个阳性血清和2个阴性血清对照。阳性血清的检出率将反映间接ELISA方法的敏感性。

3.结果

3.1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

按照方法2.2进行实验，考察抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度从而确定间接ELISA的最优条件。

方阵滴定显示，当血清的稀释度为1：100，油菜花粉过敏原稀释度为1：200，即浓度为10ug/ml，阳性血清的D450值可达0.893，阴性血清的D450为0.085，阴性与阳性血清的D450值相差最大（P/N=10.506）。因此，选择1：100为最佳血清稀释度，1：200为油菜花粉过敏原最佳稀释度。

表1间接ELISA方阵滴定结果

Table1ResultoftheindirectELISAcheekboardtitration

3.2间接ELISA阴性和阳性临界值的确定

用建立的间接ELISA方法，对10份阴性血清进行检测，得到阴性血清D450平均值为0.110，标准差为0.048，阳性临界值为0.254。

3.3敏感性试验

对39例SPT阳性血清进行100倍稀释后检测，其中35份血清值为阳性，本试验建立的间接ELISA检测法敏感性为89.7%。

4.结论

本研究根据经典ELISA的实验原理，以油菜花粉过敏原作为包被抗原，通过方阵滴定法确定间接ELISA法的最优检测条件，即油菜花粉过敏原浓度稀释度为1：200（即浓度为10ug/ml），血清血清稀释度为1：100。对10份花粉过敏阴性血清进行测定，确定D450=0.254为ELISA方法的临界值。本试验建立的间接ELISA检测法敏感性为89.7%。

参考文献：

[1]陈小文，尧荣凤，李建春，等.油菜花粉过敏原的分析鉴定与纯化[J].免疫学杂志，2011，27（3）：225-231

[2]ZhangC，GjesingB，SpangforMD，etal.Theallergen-specificitiesIgEreactivitypatternofChinesehousedustmiteallergicpatients[J].Allergy，2008，63（12）：1640-1641

[3]乔秉善.变态反应学实验技术[M].中国协和医科大学出版社.2002.30-32

作者简介：王楠（1988-），籍贯：江苏省盐城，女，硕士研究生，助教，主要从事分离纯化方面的研究，E-mail：biowangnan@126.com。