腺苷预处理对糖氧剥夺损伤星形胶质细胞的影响

腺苷预处理对糖氧剥夺损伤星形胶质细胞的影响

韩艳艳栗延伟谭军尉娜（通讯作者）

韩艳艳栗延伟谭军尉娜（通讯作者）

（新乡医学院第三附属医院神经内二科河南新乡453003）

【摘要】目的：观察糖氧剥夺对星形胶质细胞（Astrocyte，Ast）的影响及腺苷的保护作用。方法：体外培养SD大鼠大脑皮层Ast，培养至第四代时传代至96孔板内，待细胞贴壁并融合、长出突起后，随机分为三组：正常对照组(normalcontrolgroup)、糖氧剥夺组（oxygenglucosedeprivationgroup,OGDgroup）、腺苷预处理组（adenosinegroup,ADOgroup），进行糖氧剥夺/复氧糖处理。观察糖氧剥夺8h复氧糖24h后Ast的细胞活率及培养液中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）的浓度。结果：OGD组Ast活性明显低于对照组，LDH浓度高于对照组；ADO组细胞活率明显高于OGD组，LDH浓度低于OGD组（P＜0.01）；3组间两两比较细胞活率及细胞培养液中LDH浓度差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：腺苷能减少糖氧剥夺Ast的损伤，减少糖氧剥夺后Ast凋亡，腺苷预处理对缺糖缺氧Ast有一定的影响。

【关键词】腺苷缺血预处理糖氧剥夺星形胶质细胞乳酸脱氢酶

【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）16-0078-02

TheInfluenceofAdenosinePreconditioningonOxygen-glucosedeprivationinjuryinvitroastrocytecells

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofoxygen-glucosedeprivationandprotectiveeffectofadenosineonastrocytes.MethodsAstrocyteswereculturedforfourthgenerationinvitro,andthenpassagedat96wellplate.Whentheastrocytesattachingtothewallandgrowingwithprominences,theywererandomlypidedinto3groups,normalcontrolgroup,oxygen-glucosedeprivation(OGD)groupandadenosinepreconditioning(ADO)group.ThecellsweretakenOGD/reoxygenationtreatment.TheconcentrationofLDHofastrocytecellswereobservedat8hoursafterOGDand24hoursafterreoxygenation.ResultsThecellviabilityintheOGDgroupandADOgroupproducedasignificantdecrease.theviabilityinADOgroupwerehigherthanthatofOGDgroup(P<0.01).Comparedwiththenormalgroup,theLDHconcentrationinOGDgroupwassignificantlyincreased,comparedwithOGDgroup,LDHconcentrationinADOgroupobviouslydecreased(P<0.01).Thereweresignificantdifferencesbetweeneachtwogroups(allP<0.01).ConclusionsAdenosinecouldreducetheinjuryandapoptosisofoxygen-glucosedeprivation,andwecanconclusionthatadenosinehasinfluenceonastrocytesafteroxygen-glucosedeprivation.

【Keywords】adenosine;ischemiapreconditioning;oxygen-glucosedeprivation;astrocyte;lactatedehydrogenase

脑血管疾病目前已成为我国第一位致残和致死性病因，缺血性卒中的发病率在脑血管疾病中占到80%～85%[1]。然而，目前对缺血性卒中尚无确切有效的治疗方法，因此，积极寻找新的治疗方法显得尤为重要。Ast在中枢神经系统中起着关键作用，对神经元起到保护和支持作用早已得到公认。研究表明，腺苷及其受体在多种脏器的缺血再灌注损伤的保护方面都起到重要作用[2.3]，而在Ast上就存在大量的腺苷受体[4]。本研究选取体外培养的SD大鼠大脑皮层Ast作为研究对象，传代至第4代，给予腺苷预处理后，建立体外脑缺血损伤模型，观察损伤后Ast活率及测定细胞培养液中LDH的渗出情况，从而探讨糖氧剥夺后腺苷预处理对Ast的保护作用，为临床治疗提供一条思路。

1、材料与方法

1.1实验动物选取出生48小时内的Sprague-Dewley（SD）大鼠，雌雄不限，体重约10-12g。由新乡医学院动物实验中心提供。

1.2主要试剂及仪器DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）高糖培养基、无糖培养基（Gibico公司）；小牛血清购于（杭州四季青公司）；XTT、PMS（Sigma公司）；兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白GFAP多克隆抗体（中杉金桥公司），FITC标记羊抗兔IgG，封闭用羊血清（博奥森公司）；腺苷（Amresco公司）；乳酸脱氢酶ELISA试剂盒（武汉华美生物科技有限公司）；CO2恒温细胞培养箱（Heraeu公司）、EclipseE200倒置显微镜拍照系统（日本Nikon公司）、细胞缺氧装置(自制)、BIO-TEKELX800酶标仪（美国宝特仪器有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1Ast的培养参照俞爱青[5]的方法行体外SD大鼠大脑皮层Ast培养:在无菌超净台取材后利用机械分离法和差速贴壁法纯化、培养Ast，按1×109L-1密度接种至细胞培养瓶，根据细胞生长情况，2-3d半量换液1次。培养原代细胞至瓶底铺满约80-85%后，即可进行传代，传代细胞生长较快，一般5-7d即可再次传代，取第3代细胞进行GFAP荧光鉴定（根据说明书操作），经确定培养为Ast，取第4代细胞进行下一步实验。

1.3.2实验分组及处理过程取第4代Ast，根据监测指标要求，细胞传代时将其传至96孔板内，随机分为实验对照组、OGD组和ADO组。实验对照组不进行糖氧剥夺，在糖氧剥夺期及复氧糖期均全量更换一次完全DMEM培养基。OGD组在糖氧剥夺期全量更换为无糖、无血清DMEM培养基；ADO组在进行糖氧剥夺处理前24h给予腺苷浓度为100μmol/L的完全DMEM培养基进行预处理，糖氧剥夺期及复氧糖时处理同OGD组。

1.3.3糖氧剥夺/复氧糖过程OGD组和ADO组在糖氧剥夺期分别更换为预热的无糖DMEM培养基，去培养板盖，将96孔板放入自制密闭、已消毒的容器内（缺氧仓）进行缺氧处理，使其温度保持在(37±0.5)℃，然后从入口持续充入缺氧混合气体（含体积分数为95％N2和5%CO2），出口接入水密封瓶。缺氧气体由密闭仓顶部进入，后由底部排出，最初流量为10L/min，6min后仓内O2浓度降至1%，再以1L/min的流量持续充入缺氧混合气体，此时开始计时，缺氧处理8h。8h后取出培养板，OGD组及ADO组均更换为预热的高糖DMEM培养基,转移到细胞培养箱内继续培养24h。根据实验设计检测以下试验指标。

1.3.4检测指标观察糖氧剥夺8h复氧糖24h后各组Ast细胞活性变化及细胞培养液中LDH浓度。

1.3.4.1细胞活性检测OGD组和ADO组经过糖氧剥夺及复氧糖处理后，与实验正常对照组一起，各孔加入复氧糖培养基100uL,在复氧糖22h时，每孔加入预温37℃、50μL的XTT复合溶液。将细胞培养板放入培养箱内继续孵育2小时，用450nm波长测定光密度值（OD值），按如下公式计算细胞存活率：

细胞存活率（%）=（样本吸光度-空白组吸光度）/对照组吸光度×100%

1.3.4.2ELISA试剂盒进行大鼠乳酸脱氢酶（LDH）酶联免疫分析（操作按照试剂盒步骤进行）

1.4统计学处理方法所有数据均采用SPSS13.0软件包进行统计学分析处理，计量资料以均数±标准差（x-±S）表示，多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较均采用LSD检验，P＜0.01为有显著性差异。

2.实验结果

2.1XTT比色法检测细胞活性（对照组、OGD组、ADO组）

通过对XTT比色法的OD值进行单因素方差分析制得表1和图表1。由图表可知，OGD模型组Ast活力下降，OD值明显低于正常对照组（P﹤0.01），表明Ast因氧糖剥夺受损伤或死亡而导致Ast活力下降；ADO组Ast活力显著高于OGD模型组，表明腺苷预处理能明显改善细胞活力（P﹤0.01）。

表1氧糖剥夺各组XXT法细胞活性比较（x-±S）

注：与正常对照组相比，△P﹤0.01；与OGD组相比，★P﹤0.01。

Fig1ThecellviabilityofineachgrouptreatedbyOGD

2.2乳酸脱氢酶（LDH）酶联免疫分析

通过LDH酶联免疫分析试剂盒检测后进行单因素方差分析制得表2和图2。由图表可知，OGD组培养液中LDH含量明显高于对照组(P﹤0.01)，表明Ast受到氧糖剥夺损伤后损伤严重；ADO组与OGD组相比LDH含量显著降低（P﹤0.01），表明细胞损伤较OGD组细胞轻。

表2氧糖剥夺各组细胞乳酸脱氢酶释放量的比较（x-±s）

注：与正常对照组相比，△P﹤0.01；与OGD-R组相比，★P﹤0.01。

Fig2Theconcentration1ofLDHindifferentgroupsinjuredbyOGD/R

3.讨论

缺血再灌注损伤是临床上常见的基本病理生理过程，人们对它进行了大量的相关研究。临床中的短暂性脑缺血发作(transientischemicattack，TIA)，即为缺血预处理，能刺激机体内保护因子，可以减轻大脑缺血组织的病变程度，诱导脑缺血耐受[6]（ischemiatoleranceIT），抵抗以后更为严重的脑缺血。

随着对缺血耐受现象研究的深入,也逐渐拓展了缺血耐受的概念,预处理的方法也不再仅仅局限于脑缺血。毕竟在临床工作中，在脑缺血可能发生之前给予一次短暂性缺血进行预处理太不切合实际。因此,有人提出了药物预处理的概念,即通过药物模拟或激发机体内源性物质,如缓激肽、腺苷和NO等而发挥保护作用。脑缺血缺氧时引起腺苷(腺嘌呤核苷)释放,腺苷作为一种神经递质与G蛋白偶联受体(主要是受体A1)相结合后,激活ATP依赖的钾离子通道,可降低细胞膜对钙离子的通透性，同时，可抑制炎性细胞的黏附和浸润，抑制血小板聚集，以及减轻自由基和炎性细胞导致的血管内皮损伤[7]。作为临床中比较普及的药物，腺苷用于缺血预处理有以下优点：成本低，作用效果好，并且该实验组在在体动物实验及细胞方面研究腺苷预处理方面已取得了一定的成果[8]。

腺苷能减少氧糖剥夺后神经元的损伤,提示腺苷对氧糖剥夺海马神经元细胞具有一定的保护作用[9]。Ast是中枢神经系统中数量最多的神经细胞，除了具有固定神经元的功能，对神经元起支持和营养作用外，人们逐渐认识到它在调节中枢神经系统功能中发挥着很关键的作用。激活后的Ast可以表达多种神经递质、细胞因子及神经营养因子等，影响神经元的功能和存活，从而参与不同神经系统疾病的发病机制。体外培养Ast制作模拟体内缺血再灌注的方法，在一定程度上更能直接观察Ast的生长情况及更好的用于实验。

LDH是组织细胞无氧酵解中的一个关键酶，当细胞膜的完整性遭到破坏，通透性增高时，可以引起LDH漏出增加[10]。因此，该实验组把测定各组培养液中LDH活性作为评价Ast损伤程度的指标。LDH升高还可以作为指示来判断新生儿12h内缺氧是否严重及程度，成为新生婴儿和围产期窒息预后标志物[11]。XTT可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原，能间接反映活细胞的生存和增殖情况。通过检测各实验组XTT的OD值和LDH的含量，亦能够评判Ast的损伤程度。

该实验结果表明，OGD组Ast对XTT的摄取能力显著下降，LDH含量明显增高；形态学观察Ast细胞的突起减少或消失，细胞肿胀变圆，部分细胞裂解成碎片，高倍显微镜下显示Ast排列比较杂乱。ADO组细胞培养液LDH含量明显下降，较OGD组低，差异明显（P<0.01）；形态学观察细胞突起结构消失减少，细胞损伤明显减轻。实验结果提示，氧糖剥夺对体外培养的Ast可造成严重的损伤，随着复氧糖时间的延长，Ast的损伤逐渐加重；腺苷预处理可减轻氧糖剥夺Ast的损伤，具有一定保护作用。

因此本实验观察到的腺苷能减少缺糖缺氧后星形胶质细胞的损伤,减少缺糖缺氧后再恢复糖和氧供应后的星形胶质细胞的凋亡,提示腺苷对体外培养的缺糖缺氧星形胶质细胞具有一定保护作用。

参考文献

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