人肝癌血管内皮生长因子受体3逆转录病毒载体构建

人肝癌血管内皮生长因子受体3逆转录病毒载体构建

魏春山1童光东1(通讯作者)王宏艳2

魏春山1童光东1(通讯作者)王宏艳2

(1广州中医药大学深圳附属医院<深圳市中医院>广东深圳518033)

(2华中科技大学同济医学院附属同济医院湖北武汉430074)

【摘要】目的构建在人肝癌HepG2细胞内可稳定表达血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)的逆转录病毒载体。方法采用PCR技术扩增VEGFR3片段，克隆至pBABE-puro质粒，构建重组质粒pBABE-puro-VEGFR3，经PCR、酶切、测序等验证后，体外与PIK包装质粒共同转染293FT细胞，获得携带VEGFR3基因的重组逆转录病毒，感染人肝癌HepG2细胞，获得转入VEGFR3的HepG2细胞，通过QPCR和Westernblot进一步验证VEGFR3在HepG2细胞内的表达。结果①获得携带VEGFR3基因的重组质粒pBABE-puro-VEGFR3和人肝癌细胞株HepG2-pBABE-puro-VEGFR3；②QPCR和Westernblot分别检测到VEGFR3在靶细胞HepG2-pBABE-puro-VEGFR3中的稳定表达。结论成功构建了携带VEGFR3基因的人肝癌细胞重组逆转录病毒载体。

【关键词】血管内皮生长因子受体3逆转录病毒载体HepG2细胞

【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）17-0049-04

ConstructionofaRetroviralVectorofHepG2CellLineCarryingVascularEndothelialGrowthFactorReceptor-3

TONGGuang-dong1,WEIChun-shan1,WANGHong-yan2

1ShenzhenhospitalaffiliatedtoGuangzhouuniversityofChinesemedicine(ShenzhentraditionalChinesemedicinehospital),Shenzhen,518033,Guangdongprovince

2TongjihospitalaffiliatedtoTongjimedicalcollegeofHuazhonguniversityofscience&technology,Wuhan,430074,Hubeiprovince

【Abstract】ObjectiveToconstructaretroviralvectorcarryingvascularendothelialgrowthfactorreceptor-3(VEGFR3)andtransfectVEGFR3intoHepG2cells.MethodsVEGFR3genewasamplifiedbyPCRandsubclonedintotheretroviralvectorpBABE-purotoconstructaretroviralplasmid(pBABE-puro-VEGFR3)expressingVEGFR3.TheVEGFR3geneinsertwastestedbyPCR,restrictionenzymedigestion,andDNAsequencing.TherecombinantretrovirusescarryingVEGFR3wereproducedin293FTcellsco-transfectedwithpBABE-puro-VEGFR3andthepackagingplasmidsPIK,andtheninfectedHepG2cells.TheVEGFR3mRNAandproteinexpressionsweredeterminedbythereversetranscription-PCRandWesternblotting,respectively.ResultsTheretroviralplasmidcarryingVEGFR3(pBABE-puro-VEGFR3)wasconstructedsuccessfully.TheexpressionsofVEGFR3mRNAandVEGFR3proteininhepG2cellsafterdeliveredVEGFR3intopBABE-puro-VEGFR3couldbedetectedbyQPCRandWesternblot.ConclusionTherecombinantretrovirusvectorhepG2-pBABE-puro-VEGFR3hasbeensuccessfullyconstructed,whichcanstableexpressVEGFR3protein.

【Keywords】VEGFR3retrovirusvectorHepG2cell

血管和淋巴在肿瘤生长中发挥着重要作用，肿瘤相关血管/淋巴的产生与否取决于血管/淋巴生成促进因子和血管/淋巴生成抑制因子的共同调节[1]。目前认为，在血管内皮生长因子家族成员特异性结合的受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)中，VEGFR1和VEGFR2在调节肿瘤血管生成上起核心作用，而VEGFR3在不同的发育阶段有不同的作用，有一定独特性[2]，如通过癌周肝组织的各受体亚型表达的不同可预测肝癌切除术后肿瘤进展类型和结局[3]。为进一步研究VEGFR3对肝癌发生发展的影响，本实验采用逆转录病毒载体系统，拟构建携带VEGFR3的逆转录病毒载体质粒，经包装产毒并感染人肝癌HepG2细胞，以获得稳定表达VEGFR3的肝癌细胞株。

1材料与方法

1.1材料

细胞和质粒：pBABE-puro逆转录病毒质粒购自Addgene公司、包装质粒PIK、HepG2细胞、人胚肾上皮细胞系293FT细胞由广州中医药大学深圳附属医院中心实验室保存。

试剂和引物：限制性内切酶(NewEnglandBiolabs公司)；质粒提取试剂盒，DNA凝胶纯化试剂盒，DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；T4DNA连接酶，DNA聚合酶，DNAmarker，PCR试剂盒，Sybrgreen染料，Trizol，MMLV-RT逆转录酶，dNTP(大连TaKaRa公司)；感受态大肠杆菌DH5α(本实验室制备)；RT-PCR试剂盒(TOYABA公司)；引物合成(上海英骏生物技术有限公司)；胎牛血清，DMEM培养基，1640培养基(美国HyClone公司)；Anti-VEGFReceptor3antibody(美国Abcam公司)等，购自广州英韦创津生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1构建VEGFR3逆转录病毒表达载体质粒以人cDNA为模板，PCR获得VEGFR3目的基因片段。对NCBI上已提交VEGFR3基因序列(NCBI登录号为AY233382)进行分析，结果：pBaBe-puro可使用BamHI和BglⅡ进行酶切，VEGFR3可使用BamHI进行单酶切，置于启动子之后(BamHI和BglⅡ为同尾酶)。由于VEGFR3编码序列大约3914bp，以Primer5.0设计引物：

VEGFR3-F:5'CGGGATCCGCCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGT3'

VEGFR3-R:5'CGCGGATCCCTACCTGAAGCCGCTTTCTTGTC3'

利用PCR扩增VEGFR3基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根)回收目的片段，把VEGFR3基因的胶回收产物和pBaBe-puro载体分别用用BamHI和BglⅡ进行酶切回收，用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经过菌落PCR，酶切鉴定后送去英骏公司测序。

1.2.2VEGFR3重组逆转录病毒的包装取对数生长期293FT细胞接种于10cm培养皿(0.1%明胶包被10min)，转染前2小时换新鲜培养基。制备质粒混合物于1.5mlAEP中：ddH2O110μl，1MCaCl250μl，PIK(包装质粒)20μg，2XHBS200μl，pBaBe-puro-VEGFR3\pBaBe-puro质粒20μg。室温放置20min，将质粒混合物均匀加入待转染293FT细胞皿中，轻轻摇动混匀。37℃孵箱6小时。弃掉培养基，PBS洗3次，换新鲜培养基，37℃孵育过夜。吸取上清作为初始病毒液体，后每3hr收集一次，共3-4次。每次吸取的上清以0.45μm的醋酸纤维素滤膜滤器过滤，分装1.2ml/cryotube-80℃保存。

1.2.3逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞温育病毒，polybrene，人肝癌细胞(HepG2)细胞培养基。6cm皿中加入含有VEGFR3逆转录病毒颗粒的293FT细胞上清液2ml(含2μg/mlpolybrene)。37℃孵育3小时，吸弃，换新病毒上清3hr，重复2次(共3次感染)，同时设不加VEGFR3的空白对照组。后加靶细胞培养液48小时后，抗生素puro(0.5ug/ml)筛选细胞。转染VEGFR3逆转录病毒的细胞，标记为HepG2-pBABE-puro-VEGFR3细胞；感染空载病毒的对照细胞，标记为HepG2-pBABE-puro细胞。

1.2.4QPCR检测采用Sybrgreen染料法，以β-actin为内参基因，对于检测VEGFR3mRNA的表达量，首先设计RealtimePCR引物，应用DNAstar软件设计，由invitrogen公司合成。序列如下表所示：提取总RNA，用MMLV-RT逆转录酶合成cDNA，QPCR扩增和检测均按说明书操作。

图2pBaBe-puro-VEGFR3鉴定

1泳道：MarkerD15000(上到下条带大小分别为15000bp,10000bp,5000bp,2500bp,1000bp)

2泳道：VEGFR3,3914bp。

2.3经QPCR检测，从携VEGFR3重组基因组扩增曲线和融解曲线(图3)显示，基因扩增产物单一，引物设计成功，可进行量化分析。定量分析结果显示，VEGFR3在HepG2-pBABE-puro-VEGFR3细胞中强表达，而在空白对照组细胞中弱表达(图4)，两组比较有统计学差异(P＜0.05)。

图5Westernblot检测转染后HepG2细胞株VEGFR3表达情况

1：HepG2-pBABE-puro-VEGFR3；2：HepG2-pBABE-puro

3讨论

原发性肝癌(HCC)是一种恶性程度极高的恶性肿瘤。自从1960年，Folkman[4]提出“肿瘤生长是血管依赖性的”之后，人们越来越多的关注血管与肿瘤的关系，而肿瘤的生长、转移依赖于肿瘤血管及淋巴的生成，因而作用于血管与淋巴管生成的肿瘤治疗成为当前肝癌研究的热点之一，且主要集中于抗血管增殖相关制剂的研究，如血管抑素和内皮抑素[7]，鱼藤素，三氧化二砷(As2O3)等直接或间接抗HCC血管生成的药物；以及针对VEGF及其受体的HCC血管生成抑制剂，如贝伐单抗、吉西他滨和奥沙利铂联用，近年来由拜耳公司推出的Sorafenib也是从抑制血管生成途径治疗肝癌的[8]。国内也有人使用中药复方制剂如鳖甲煎丸等[9]开展相关临床观察。

由于VEGF信号的细胞内转导可能涉及多种途径[10]，首先需要活化受体，使其具有酪氨酸激酶活性，对家族成员结合的多种受体的研究也成为关注焦点[5,6]。其中，VEGFR3的作用独特，在胚胎的生长期，心血管形成受VEGFR3影响明显,卵黄膜会因VEGFR3缺陷而出现异常血管网，胚胎最终死于心血管功能衰竭[11]；在后期,VEGFR3将逐步局限在淋巴管的内皮细胞，能促进淋巴管增殖[12]，而在血管中鲜有表达[13,14]。有人[15]已将VEGFR3作为非胃肠基质瘤软组织恶性肿瘤的一个强而独立的阴性预测标志物应用于外科切除手术。尽管有人尝试分析诱导肝癌发生的乙肝病毒x基因与VEGF的表达相关性并认为有一定正相关关系[16]，但尚未获得循证依据和公认结论，对VEGFR3在肝癌发生中的机制及干预研究，亦仅有LianZ等[17]极少探索性报道。

而要了解VEGFR3等VEGFR在肝癌形成和发展中的作用机制，开展涉及VEGFR3途径防治HCC发生发展的临床和实验研究，获得高效稳定的VEGFR3细胞模型是研究的前提。目前多采用转染的方法将目的基因转入宿主细胞，如腺病毒表达系统[18]，可短时间瞬时表达外源基因，感染分裂细胞和不分裂细胞，但在体内会引起免疫反应，瞬时转染不一定能将目的基因整合到宿主染色体中，随着时间的延长，转染质粒可能会因细胞减数分裂最后慢慢丢失。而采用逆转录病毒载体系统，逆转录病毒DNA能整合于宿主基因组内，长时间稳定表达外源基因，使其随细胞分裂而传代、能长期高效稳定的表达。

本研究是以人正常肝细胞HepG2为研究对象，将VEGFR3基因克隆连接入pBABE-puro逆转录病毒质粒，首先获取pBABE-puro-VEGFR3重组质粒，将其与包装质粒PIK共转染293FT细胞，并感染靶细胞HepG2人肝癌细胞，获得可以长期稳定表达VEGFR3蛋白的HepG2-pBABE-puro-VEGFR3细胞株，为进一步探讨VEGFR3与肝癌的机制研究及以VEGFR3为靶向进行实验和临床干预乙肝病毒相关肝癌的研究提供了较为理想的细胞模型。

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基金项目编号国家自然科学基金资助项目

(编号：30873245)；深圳市科技计划项目(NO:201202154)