狂犬病疫苗灭活工艺研究

狂犬病疫苗灭活工艺研究

王雪云董文娟高红云梁海岩

山东亦度生物技术有限公司257000

摘要：采用不同浓度的β-丙内酯（BPL）灭活狂犬病毒株收获液，在灭活后的不同时间取样检测病毒滴度及抗原含量，并对灭活后的样品进行病毒灭活试验。结果，三种不同浓度的β-丙内酯在4℃条件灭活24h后，样品内均未检测到病毒，较高浓度β-丙内酯对病毒抗原含量损失较大。

关键词：β-丙内酯；灭活；病毒滴度；抗原含量；细胞培养

狂犬病系病毒性人兽共患病，在全球100多个国家和地区均有发生。一旦发生临床症状，狂犬病几乎100%死亡。因此，预防和接种狂犬病疫苗是控制该病的重要手段。在狂犬病疫苗制备过程中，狂犬病毒的灭活是狂犬病疫苗生产工艺中关系安全性和有效性的重要环节。国内外已将β-丙内酯广泛用于各种疫苗的生产灭活工艺，但不同病毒株及疫苗适应株对β-丙内酯灭活浓度及时间要求不一致[1]，本实验狂犬病疫苗以适应Vero细胞的PV株为毒株生产疫苗，采用不同浓度的β-丙内酯进行灭活试验，在不同的灭活时间取样，观察狂犬病毒灭活效果、病毒引起细胞病变及抗原含量变化，为疫苗制备生产工艺提供指导和依据。

1材料与方法

1.1材料

狂犬病病毒Vero细胞适应株收获液由本公司生产。

人用狂犬病疫苗中病毒抗原相对含量检测试剂盒（酶联免疫法）；武汉生物制品研究所有限责任公司；Vero细胞；中国食品药品检定研究院提供。

1.2方法

将病毒收获液按终浓度为1:2000、1:4000、1:8000的比例加入β-丙内酯，置4℃条件下灭活24小时，37℃水浴2h后结束灭活。灭活过程中分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、16h、24h取样，采用LD50法检测病毒滴度。同时对取样采用ELISA双抗体夹心法检测抗原含量。

同时将0h、1h、2h、4h、6h取样接种在Vero细胞上，接种后培养观察7天，观察细胞病变情况，未出现细胞病变孔每7天传一代，继续观察细胞病变情况。

灭活结束后，将三个浓度分别取样，进行病毒灭活验证。接种Vero细胞，37℃吸附60分钟后加入细胞培养液，培养21天后收获培养液，脑内接种体重为11~13g小鼠20只，每只0.03ml；观察14天，应全部健存。

2结果

2.1狂犬病病毒滴度

将病毒收获液按终浓度为1:2000、1:4000、1:8000的比例加入β-丙内酯，置4℃条件下灭活，0.5h后病毒毒力迅速下降，1:2000组在灭活1h后检测不到病毒；1:4000组在灭活2h后检测不到病毒，1：8000组灭活4h后检测不到病毒，灭活24小时后三组均未检测到病毒，灭活效果完全。

2狂犬病病毒抗原含量

通过ELISA方法检测抗原含量，灭活0.5h后抗原含量均有降低，1:2000浓度组抗原损失较大，灭活2h后各浓度组抗原含量基本保持稳定。

2.3细胞培养观察试验结果

1:2000、1:4000浓度组灭活2h后未见细胞病变，1:8000浓度组灭活后4小时后未见细胞病变，将未出现细胞病变孔的细胞盲传，细胞生长良好。

2.4病毒灭活验证试验

取三种浓度灭活后的病毒液接种Vero细胞传代后，收获液接种小鼠，观察14天后，小鼠全部健存，灭活试验均成立。

3讨论

β-丙内酯是一种杂环化合物，对病毒具有很强的灭活作用，其作用机制是通过与嘌呤碱基（主要是鸟嘌呤）反应改变病毒核酸结构达到灭活病毒，不直接作用于蛋白质，能保持良好的免疫原性[2]，它能在体内完全分解为无毒性的β-羟丙酸，这是一种人体内脂肪代谢后的产物，对人体和动物无毒性。

本研究探讨了β-丙内酯浓度及灭活时间对病毒灭活效果及病毒抗原含量的影响，结果表明，β-丙内酯浓度不同，所需完全灭活病毒时间不同，1:2000、1:4000、1:8000分别在灭活1h、2h、4h后检测不到病毒，灭活24h后均检测不到病毒。1:2000组灭活过程中对抗原含量损失较大，在完全灭活后继续延长灭活时间，不同浓度组对抗原含量损失没有明显影响。本实验结果也表明狂犬病毒对Vero细胞易感。动物法与细胞培养法检测病毒灭活，两者具有正相关趋势，1:8000组灭活4h后，动物法已检测不到病毒，细胞培养法仍有1孔细胞出现病变，表明细胞培养法检测微量存活病毒的方法较动物法更灵敏。

因此，灭活工艺中宜选用较低浓度的β-丙内酯，以保证灭活完全及较高的抗原性；并对灭活后样品进行病毒灭活验证以确保灭活完全。

参考文献：

1蒋建江，戚风春，胡艳灵，等.β-丙内酯对甲型肝炎病毒的灭活效应[J].中国生物制品学杂志，2012,25:529-530.

2LawrenceSA.β-propiolactone:Viralinactivationinvaccinesandplasmaproducts[J].PDAJPharmSciTechnol,2000,54:209-217.