翡翠贻贝多糖治疗宫颈癌荷瘤裸鼠及对免疫系统和p53mRNA表达的影响

翡翠贻贝多糖治疗宫颈癌荷瘤裸鼠及对免疫系统和p53mRNA表达的影响

何冬梅1袁希福2李江滨3

何冬梅1袁希福2李江滨3

（1惠州市中医医院广东惠州516001)

（2上海希福抗癌免疫研究所200092；3广东医学院广东东莞523808）

【摘要】目的观察翡翠贻贝多糖治疗宫颈癌荷瘤裸鼠及对免疫系统和p53mRNA表达的影响。方法建立宫颈癌荷瘤裸鼠模型，观察翡翠贻贝多糖对荷瘤小鼠的抑瘤率及对T淋巴细胞增殖能力、血清白介素2(IL-2)、瘤体组织p53基因mRNA表达等指标的影响。结果翡翠贻贝多糖高（0.5g/kg）、中（0.1g/kg）剂量可明显抑制荷瘤裸鼠瘤体的生长(P<0.01)，提高T淋巴细胞增殖能力和IL-2的产生(P<0.01)，但对p53基因mRNA表达无显著影响（P>0.05）。结论翡翠贻贝多糖可显著抑制宫颈癌荷瘤裸鼠瘤体的生长，并能增强荷瘤裸鼠的免疫功能。

【关键词】翡翠贻贝多糖宫颈癌免疫系统p53基因

【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）16-0074-02

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来宫颈癌的发病年龄趋向年轻化，成为严重威胁中青年妇女健康的重大妇科肿瘤疾病之一。翡翠贻贝多糖(PVPS)是从海洋双壳贝类翡翠贻贝肉中提取的多糖成分。翡翠贻贝是海产双壳贝类，其药用和食疗功效显著，从中提取到的多种活性成分具有抗菌、抗病毒，抗炎，抗氧化，抗肿瘤等作用[1]。前期研究发现由翡翠贻贝肉制备的多糖对体外培养的宫颈癌细胞生长具有抑制作用[2]。为进一步探讨翡翠贻贝多糖的体内治疗宫颈癌的作用，本研究观察了翡翠贻贝多糖治疗宫颈癌荷瘤裸鼠及对免疫系统和p53mRNA表达的影响。

1材料与方法

1.1材料

翡翠贻贝多糖（PVPS），上海希福抗癌免疫研究所提供；宫颈癌Hela细胞株，广东医学院衰老研究所提供；BALB/c裸小鼠，雌性，4-6周龄，体重14-18g，广东医学院实验动物中心提供；噻唑蓝（MTT）、刀豆蛋白A（ConA），Sigma公司；DMEM培养基，Gibco公司；小牛血清，杭州四季青试剂公司；5氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司；IL-2ELISA试剂盒，eBioscience公司；TRIzol试剂，Invitrogen公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（SYBRGreen法），TaKaRa；p53引物、β-actin引物，上海生工生物工程技术公司。CO2恒温培养箱，Sanyo公司；多功能酶联反应仪，Bio-Tek公司。荧光定量PCR仪，ABI。

1.2方法

1.2.1细胞培养、荷瘤模型裸鼠建立与分组40mg/kg用含10%小牛血清的DMEM培养基在5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养宫颈癌Hela细胞，收集对数生长期的细胞，接种于裸鼠右前肢腋窝处皮下，每只裸鼠接种5×106个细胞。无特定病原体（SPF）环境饲养裸鼠，并观察裸鼠生长状态及肿瘤生长情况，以皮下结节直径>0.5cm为成瘤标准。接种次日按体重将小鼠随机分成5组，每组12只，分别为空白对照组、5-FU组（0.1g/kg）、翡翠贻贝多糖高（0.5g/kg）、中（0.1g/kg）、低（0.02g/kg）剂量组。每天每鼠灌胃给药0.1mL，连续30天。

1.2.2对荷瘤裸鼠的体内抑瘤作用末次给药24小时后摘眼球取血，分离血清待测，然后处死小鼠后剥离瘤体，称量瘤体湿重，计算抑瘤率，抑瘤率=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.2.3对荷瘤裸鼠免疫功能的影响按参考文献[3]方法检测T淋巴细胞增殖能力。取待测血清按ELISA试剂盒中的方法测定血清中IL-2含量。

1.2.4实时荧光定量PCR检测裸鼠瘤组织p53基因mRNA的表达取1.2.2操作中得到的各组裸鼠瘤体组织按试剂盒说明书进行总RNA的提取、cDNA合成、及荧光定量PCR操作，以空白对照组裸鼠瘤组织p53基因mRNA表达水平为参照计算其他各组的p53基因mRNA表达水平变化。

1.2.5统计随机分组由Eecel2003随机数发生器完成，计量数据用x-±s表示，用SPSS16.0统计软件，采用方差分析，组间比较采用t检验。

2结果

2.1对荷瘤裸鼠的体内抑瘤作用与荷瘤裸鼠对照组比较，翡翠贻贝多糖高中剂量组和5-FU组的宫颈癌瘤体生长均明显受到抑制，差异有统计学意义（P<0.01），且翡翠贻贝多糖高中剂量组间呈一定的剂量效应关系，结果见表1。

表1各试验组荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率（x-±s，n=12）

与空白对照组比较，*P<0.01；

2.2对荷瘤裸鼠免疫功能的影响与荷瘤裸鼠对照组比较，翡翠贻贝多糖高中剂量组T淋巴细胞增殖能力和IL-2均升高，差异有统计学意义（P<0.01），且翡翠贻贝多糖高中剂量组间呈一定的剂量效应关系，说明翡翠贻贝多糖能显著改善荷瘤模型裸鼠免疫功能。而5-FU组与对照组比较，T淋巴细胞增殖能力和IL-2均降低，且差异有显著性（P<0.01），说明5-FU会降低荷瘤裸鼠免疫功能，结果见表2。

表2各试验组荷瘤裸T淋巴细胞增殖能力及血清IL-2含量（x-±s，n=12）

与空白对照组比较，*P<0.01；

2.3对荷瘤裸鼠瘤体组织p53基因mRNA的表达影响与空白对照组比较，翡翠贻贝多糖各剂量组和5-FU组的p53基因mRNA表达无显著变化，差异无统计学意义（P>0.05），结果见表3。

表3各试验组荷瘤裸鼠瘤体组织p53mRNA表达（x-±s，n=12）

与空白对照组比较，△P>0.05；

3讨论

本实验对翡翠贻贝多糖(PVPS)的体内抗宫颈癌作用进行了研究。结果表明翡翠贻贝多糖高中剂量可明显抑制荷瘤裸鼠瘤体的生长，提高T淋巴细胞增殖能力和IL-2的产生，但对抑癌基因p53基因mRNA表达却无显著影响。说明翡翠贻贝多糖可能通过调节免疫功能而不是通过激活抑癌基因p53基因表达而达到抑制宫颈癌生长的作用。

近年来，多糖类天然产物的抗肿瘤作用研究日益受到重视，并取得了许多成果。多糖的药理功能主要有抗病毒、抗炎、抗衰老、免疫调节及抗肿瘤等，且具有毒副作用小、安全性高等优点。多糖最重要的功能为其免疫调节和抗肿瘤作用，在免疫调节方面，多糖能明显调节T、B、NK等细胞功能，促进Ig类抗体含量的提高，促进IL-2、IL-6等细胞因子的产生。在抗肿瘤方面，一方面多糖可以通过提高机体的细胞和体液免疫功能，促进细胞因子的合成和释放来达到抗肿瘤效果。另一方面多糖具有细胞毒性，对肿瘤细胞有直接抑制作用[4-5]。

参考文献

[1]李江滨，黄迪南．贻贝的药用价值研究进展[J]．水产科学，2004，23（11）：43-44.

[2]许子茂，李江滨，侯敢.翡翠贻贝多糖的制备及体外对Hela肿瘤细胞生长的抑制作用.中国现代药物应用，2010，4（7）：1-2.

[3]张红军，唐小云，鞠宝玲，等．玉屏风散对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响[J]．细胞与分子免疫学杂志，2008，24（7）：683-685.

[4]李循，孔繁智，朱婉萍．中药多糖抗肿瘤作用研究进展[J]．浙江中医杂志，2006，41（2）：113-116.

[5]李松，吴青华，陈畅，等．多糖抗肿瘤活性的最新研究进展[J]．中国生化药物杂志，2007，28（3）：213-215.

[基金项目]广东省中医药局科研项目（20121113）