当归补血汤逆转胃癌细胞阿霉素耐药的实验研究

当归补血汤逆转胃癌细胞阿霉素耐药的实验研究

刘灏（南方医科大学中医药学院中西医结合医院外科广东广

【关键词】胃癌当归补血汤多药耐药逆转

ReversalEffectofAngelicaeSinensisonDOXResistanceGastriccancerCelllineSGC-7901/ADR

LIUHao(DepartmentofGeneralSurgery,SchoolofTraditionalChineseMedicine,TheSouthernMedicalUniversity,GuangdongGuangzhou510315,China)

【Abstract】Objective:TostudytheimpactofAngelicaeSinensisonhumangastriccancercelllineSGC-7901andDOXresistancecelllineSGC-7901/ADR.Methods：TomeasuretoxicanteffectofDOXtoSGC-7901andSGC-7901/ADR(ADMresistantstrain)forresistantindexbyMTT;TomeasurethedirectcelltoxicanteffectofAngelicaeSinensistobothstrainsbyMTT;ToobservethereversaleffectofAngelicaeSinensiswhichhasscreenedfornontoxicanttobothstrainsbyMTT;ToobservetheextandedeffectivetimeofDOXtobothstrainsbyMTT.Results：IC50ofDoxtoSGC-7901andSGC-7901/ADRwere0.31±0.13μg/mland0.84±0.38μg/mlrespectively.Drug-ResistantindexofSGC-7901/ADRwas2.79;TherewasnoobviouscelltoxicityofAngelicaeSinensistoSGC-7901andSGC-7901/ADRcell,whentheconcentrationofAngelicaeSinensiswas300μg/mlbelow;AngelicaeSinensiscouldincreasecelltoxiceffectofDOX;Thesensitivityofhumangastriccancercellstoincreasedandtheireffectivetimewereextended.Conclusion：SGC-7901/ADRcanbeakindofsafeandefficientreversalagentforclinic.

【Keywords】GastriccancerAngelicaeSinensisMDRReversal

胃癌(Gastriccancer)是临床常见的恶性肿瘤，化疗是治疗进展期胃癌的重要手段，阿霉素作为最常用的化疗药物之一，临床上常与其他化疗药物（如5-氟尿嘧啶、顺铂）配伍用于胃癌的化疗，但是临床上胃癌化疗的效果并不满意。有文章报道胃癌对阿霉素的敏感性仅为30%，其中最主要的原因是胃癌细胞具有天然耐药性或者在化疗过程中通过接触化疗药物获得耐药性。目前，5-氟尿嘧啶与肿瘤的耐药研究较多，并且发现了能够增效5-氟尿嘧啶的增效剂四氢叶酸及其衍生物，而阿霉素研究较少。中医药在肿瘤放化疗中的增效减毒作用已被确定，研究表明，当归补血汤有增强免疫、促进造血功能、保护脏器免受有害毒物损伤的作用[1]，而且通过观察当归补血汤联合CTX抗S180荷瘤鼠发现，当归补血汤高剂量联合CTX组肿瘤抑制率高于CTX组,提示当归补血汤对CTX抗移植瘤生长具有一定增效作用[2]。本研究通过当归补血汤作用于阿霉素耐药的胃癌细胞，观察其是否能够具有逆转化疗的耐药，为本方的临床抗肿瘤应用提供实验依据。

1材料

1.1细胞株胃癌细胞株SGC-7901由南方医科大学中心实验室提供，具有多药耐药表型的耐阿霉素细胞株SGC-7901/ADR由第四军医大学西京医院消化研究所惠赠。

1.2药物及试剂当归补血汤由黄芪和当归组成（药品均经过中药专家鉴定），将药物加水浸泡20min后，煎煮3次，每次约30min，混合过滤，取汁300ml，离心取上清，80℃水浴浓缩至每毫升含生药1.2g，分装，高温消毒后，用生理盐水制成10mmol/L的工作母液。阿霉素也用生理盐水配成10mmol/L的工作母液置于4℃冰箱保存备用。

2方法

2.1实验步骤

2.1.1耐药细胞SGC7901/ADR脱药培养后药物敏感性分析采用MTT实验方法进行。实验细胞分为两组：即脱药培养后的SGC-7901/ADR细胞组和亲本细胞SGC-7901组。阿霉素在人体的血浆高峰浓度为0.4μg/ml。实验中分别加入1倍、5倍、25倍血浆高峰浓度的阿霉素。收获对数生长中期的细胞，按照每孔8000个细胞/200μl接种入96孔板，置于细胞培养箱内培养过夜；加入不同浓度的阿霉素，继续培养48h，每孔加新鲜配制MTT溶液（5g/L）20μl,37℃下继续培养4小时；选择490nm波长，在ELISA仪上测定各孔光吸收值，计算细胞的存活率：细胞存活率=（实验组A值－空白对照组A值）/（阴性对照组A值－空白对照组A值）×100%；测定耐药细胞株的耐药倍数（耐药细胞对阿霉素IC50值/敏感细胞阿霉素的IC50值）。

2.1.2当归补血汤的细胞毒性分析采用MTT实验方法进行。实验细胞分为两组：第一组为SGC-7901组加入不同浓度的当归补血汤制剂；第二组为SGC-7901/ADR组。方法同上，加入不同浓度的当归补血汤制剂溶液，使浓度分别为0,10,100,300,500,1000μg/ml，每个浓度设3个复孔。选择490nm波长，在ELISA仪上测定各孔光吸收值，计算半数抑制量IC50值。

2.1.3测定当归补血汤对SGC-7901/ADR的逆转作用分SGC-7901/ADR+DOX，SGC-7901/ADR+当归补血汤(3个浓度)+DOX，SGC-7901+DOX，SGC-7901+当归补血汤(3个浓度)+DOX组。当归补血汤浓度取第一步筛选的无细胞毒性浓度分别为50,100,200μg/ml，每个浓度设3个复孔，DOX浓度取0，0.1，1，10，100μg/ml。方法同上，计算逆转倍数(逆转前IC50值/逆转后IC50值)。

2.1.4当归补血汤对阿霉素有效作用时间的延长作用收获对数生长中期的SGC-7901细胞和SGC-7901/ADR细胞，阿霉素浓度为致SGC-7901胃癌细胞ID50的剂量；当归补血汤的浓度为50,100,200μg/ml；继续培养24h，以24h后的MTT法的光密度值为基数，每3h测定一次，至光密度值增加30％为止。

2.2统计学处理数据以x±s表示,采用SPSS11.2统计软件进行多组间单因素方差分析。

3结果

3.1耐药细胞SGC-7901/ADR脱药培养后的药物敏感性胃癌耐药细胞SGC-7901/ADR的IC50值为0.84±0.38，亲本细胞SGC-7901的IC50值为0.31±0.13，二者具有显著差异（P＜0.01），说明SGC-7901/ADR在脱药培养后保持着稳定的耐药性。耐药倍数为2.79。

3.2当归补血汤的细胞毒性分析实验表明，当归补血汤对SGC-7901细胞和SGC-7901/ADR细胞的细胞毒性很小，其在300μg/ml浓度以下时对两组细胞基本无毒性，细胞存活率均在98%以上，500μg/ml以上随着浓度的增大其细胞毒性作用明显增加。IC50值为SGC-7901细胞712.2±60.9，SGC-7901/ADR细胞为729.9±71.6。

3.3当归补血汤对SGC-7901/ADM的逆转作用不同浓度的当归补血汤能不同程度地增强DOX对SGC-7901/ADR细胞的杀伤作用，提高细胞对DOX的敏感性，表现为IC50下降，对DOX的敏感性提高至原来的1.3～2.1倍，但仍远高于敏感株SGC-7901细胞的IC50[(0.31±0.13)μg/ml]，说明PNS能降低SGC-7901/ADR细胞对DOX的抗性。见表1。

表1当归补血汤对SGC-7901/ADM的逆转作用

逆转药物SGC-7901的IC50SGC-7901/ADR的IC50逆转倍数

对照组0.31±0.130.84±0.38

DOX和50μg/ml药物浓度组0.30±0.090.65±0.431.3

DOX和100μg/ml药物浓度组0.30±0.070.53±0.341.6

DOX和200μg/ml药物浓度组0.28±0.090.40±.0462.1

注：SGC-7901/ADR所有组P<0.01

3.4当归补血汤对阿霉素有效作用时间的延长作用不同浓度的当归补血汤能不同程度地延长DOX对SGC-7901细胞和SGC-7901/ADR细胞的杀伤作用。见表2。

表2当归补血汤对阿霉素有效作用时间的延长作用

逆转药物SGC-7901SGC-7901/ADR

对照组3h6h

DOX和50μg/ml药物浓度组6h▲9h

DOX和100μg/ml药物浓度组6h▲15h★

DOX和200μg/ml药物浓度组9h★18h★

▲比较对照组P<0.05，★比较对照组P<0.01

4讨论

肿瘤化疗耐药的过程是一个多基因、多因素和多步骤的复杂过程，并且其间存在着相互依赖又相互制约的调节关系，由多种途径诱导,其机制十分复杂。肿瘤化疗耐药分为经典和非经典两大类机制[3]。其形成机制相当复杂,针对不同耐药机制的耐药逆转剂已成为肿瘤化疗研究的热点[4]。现今的化学药物往往只能从一种机制进行逆转，而中药具有多机制、多途径、多靶点进行逆转的优势，能显著提高化疗药物对肿瘤细胞的细胞毒作用，充分体现了中药的多靶点性[5]。当归补血汤出自《内外伤辨惑论》，是金元四大家之一李东垣所创造的益气补血方剂。当归补血汤由黄芪和当归两味药以5∶1组成,具有益气生血功效。现代药理学研究证实[1],当归补血汤不仅可促进造血和免疫功能,还具有强心、保护心肌细胞和保肝功能。除此之外,本方中药本身就具有抗癌作用或可通过调节机体免疫能力等作用协同化疗药物杀灭肿瘤细胞,而且在本研究中发现，当归补血汤自身毒副作用小、能够在一定程度上逆转胃癌的阿霉素耐药表型、延长化疗药物的有效作用时间。可见，如果当归补血汤能够作为阿霉素的化疗耐药逆转剂将具有比较大的优势。当然，只是通过本研究的细胞水平的实验是不够的，还需要在分子水平或基因水平探讨当归补血汤的作用机制，从而从多角度、多靶点全面了解当归补血汤抗肿瘤的机制，为临床应用提供理论依据。

参考文献

[1]范颖,陈信义.当归补血汤的实验研究进展[J].中医药学刊,2006,24(9)：1643-1646.

[2]陈鹊汀，刘智勤，朱惠学.当归补血汤联合环磷酰胺抗肿瘤实验研究[J].第三军医大学学报，2008,30（16）：1568-1570.

[3]HwangJJ.Roleofchemotherapyinthetreatmentofgastroesophagealcancers.Oncology(WillistonPark),2007Apr;21(5):579-86,discussion587,591-592.Review.

[4]侯炽均.中药对肿瘤细胞凋亡研究述评[J].中医研究,2005,18(3):57–60.

[5]潘文萍.中药逆转肿瘤多药耐药的研究进展[J].山东中医杂志,2006,25(6):426–428.