黄连碱在人肝微粒体中的代谢研究

黄连碱在人肝微粒体中的代谢研究

谭殷呙敏

邵阳市中医医院湖南邵阳422000

摘要：目的研究黄连碱在人肝微粒体中的代谢情况。方法先进行酶促动力学参数实验，计算出酶促动力学参数；再检测CYP450亚酶专属性抑制剂对黄连碱代谢的影响，推测参与黄连碱代谢的CYP酶亚型，最终推断代谢产物结构。结果在人肝微粒体中黄连碱代谢的米氏常数Km为6.8027μmol/L，最大代谢速率为Vmax=0.5476nmol/（mgprotein·min），肝清除率为CLint=0.008ml/（mg·min）。甲氧沙林、奎宁、酮康唑在一定程度上对黄连碱的代谢有抑制作用。黄连碱在人肝微粒体中的代谢产物是黄连碱丢失一个亚甲基结构。结论甲氧沙林、奎宁、酮康唑可能参与黄连碱在人肝微粒体中的代谢，黄连碱的代谢产物为脱亚甲基黄连碱。

关键词：黄连碱人肝微粒体代谢酶促动力学亚甲基

黄连碱是一种天然的异喹啉类生物碱，是中药黄连主要化学成分之一，在白屈菜、延胡索、苦地丁、人血草等其他多种植物中也存在。黄连碱具有广谱抗菌活性，调节血脂、降血糖的作用[1]。近年来，对黄连碱的研究主要集中在药理作用方面，对黄连碱代谢方面的研究非常少。药物代谢对药物作用产生重要影响，因此对黄连碱代谢的途径、参与代谢的酶及代谢后的产物进行研究有效提高对黄连碱的认识。本研究采用人肝微粒体体外温孵法对黄连碱的酶促动力学进行研究，并对CYP450亚酶专属性抑制剂进行测定，从而推测可能参与黄连碱代谢的CYP450亚酶类型，并研究黄连碱在人肝微粒体中的代谢产物。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

仪器：1、江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司生产的涡旋振荡器，型号：Vortex-5；2、太仓市华美生化仪器厂生产的恒温振荡培养箱，型号：HZQ—X100；3昆山市超声仪器有限公司生产的超声波清，型号：KQ5200DB；4、Agilent1290超高效液相一G6460三重串联四极杆质谱联用仪。

试剂：α-萘黄酮，磺胺苯吡唑，4-甲基吡唑，酮康唑，氟康唑，甲氧沙林，奎宁，盐酸黄连碱，四氢小檗碱，人肝微粒体，PBS缓冲液，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐还原型，甲醇，乙腈。

1.2方法

温孵体系总孵育体积为0.2ml，其中包括1mmol/LNADPH、人肝微粒体及盐酸黄连碱。以磷酸缓冲液为介质。将配置好的温孵液放置于37℃振荡孵育固定时间后立即将其取出，并采用同体积的冷乙腈终止反应，涡旋震荡后离心10min，过滤后采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测。

人肝微粒体质量浓度的确定：设定人肝微粒体蛋白质量浓度为0-2mg/ml，温孵时间90min后，黄连碱代谢率随着人肝微粒体蛋白质量浓度的增大而增大。但人肝微粒体质量浓度在1.2mg/ml时，代谢率增加速度减慢，故选择人肝微粒体质量浓度为1.2mg/ml。见图1.

温孵时间确定：人肝微粒体质量浓度为1.2mg/ml。将配置好的温孵液放置于37℃振荡孵育0、5、15、30、60、90、120min，对黄连碱的质量浓度进行检测，结果发现90min后，黄连碱的质量浓度趋于稳定，故确定温孵时间为90min。见图2.

黄连碱浓度的确定：将不同浓度的黄连碱标准溶液加入人肝微粒体温孵液中，黄连碱的浓度分别为1、10、20、40、60、80、100μmol/L，人肝微粒体质量浓度为1.2mg/ml，温孵90min后，对样品进行测定。结果显示黄连碱浓度为66.2μmol/L时，代谢接近饱和。见图3。

代谢速率以温孵液中黄连碱浓度的减少量除以温孵时间和人肝微粒体质量浓度表示。代谢速率=黄连碱浓度的减少量/温孵时间·人肝微粒体质量浓度。

酶促动力学参数：代谢速率和黄连碱浓度计算米氏常数、最大代谢速率及肝清除率

抑制性实验：测定CYP450专属性抑制剂对黄连碱代谢影响，选用抑制剂有甲氧沙林（CYP2A6），氟康唑（CYP2C19），α-萘黄酮（CYPlA2），奎宁（CYP2D6），酮康唑（CYP3A4），4-甲基吡唑（CYP2E1），磺胺苯吡唑（CYP2C9）各试剂浓度均在0-100μmol/L之间。所有抑制剂均溶解在甲醇中，并与等量的不含抑制剂的甲醇作对比。

黄连碱代谢产物测定：准备配置好的样品、不加黄连碱的样品及加入NADPH后不经过温孵立即终止反应的样品。对这三种样品进行检测对比。

2结果

2.1米氏常数、最大代谢速率及肝清除率

根据代谢速率和黄连碱浓度做Linewearver-Burk双倒数曲线，横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax，计算米氏常数Km=6.8027μmol/L，最大代谢速率为Vmax=0.05476nmol/（mgprotein·min），肝清除率为CLint=0.008ml/（mg·min）。

2.2参与黄连碱代谢的CYP450亚酶

实验表明，甲氧沙林、奎宁、酮康唑的代谢率随着浓度的增加而降低，其他抑制剂则无明显变化，由此表明，在一定程度上能抑制黄连碱的代谢，由此可推测CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4）参与黄连碱的代谢。

2.3黄连碱代谢产物

检测结果表明，配置好的温孵液较其他两种样品脱去一个亚甲基结构，由此可推断，黄连碱在人肝微粒体中的代谢产物是黄连碱脱去一个亚甲基结构。

3讨论

黄连碱是黄连的主要成分之一，其结构与小檗碱非常相似，已有相关研究表明，小檗碱具有良好的抗菌活性，且对于调节血脂、降血糖效果显著，临床中，已将小檗碱于其他治疗糖尿病药物联合用于糖尿病的治疗。目前，在临床中小檗碱的使用率明显要高于黄连碱，这可能由于黄连碱来源没有小檗碱广泛，使其使用受限。但近年来，随着医学的不断发展，对黄连碱的研究逐渐增多。对黄连碱的药理进行研究发现，黄连碱能有效抑制血管平滑肌增殖、抑制A型单胺氧化酶，并能选择性的对血管平滑肌细胞中的多药耐药蛋白质表达进行调节[3]。血管平滑肌细胞一旦出现异常和增值，可导致高血压、冠状动脉粥样硬化等疾病。血管平滑肌增殖与血管疾病的发生也有着密切联系。一些复杂的局部环境如炎性刺激、生长因子、机械应激等对血管平滑肌细胞可产生刺激，进而影响血管平滑肌增殖和分化。有效抑制血管平滑肌增殖使减少血管疾病，保护血管平滑肌细胞去分化及诱导其凋亡具有的重要作用。黄连碱的多项药物作用都优于小檗碱，故黄连碱的应用前景较好。因此对黄连碱的代谢情况进行研究具有重要的现实意义。细胞色素P450，简称CYP450，是一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢[2]。CYP450已是世界公认的人类最重要的代谢酶系统，其可对不同结构的外源化合物进行作用，使其生物转化。CYP450酶可催化约90%的药物氧化。

本次实验中重点研究黄连碱的代谢情况，采用酶促动力学实验，计算出酶促动力学参数。黄连碱在人肝微粒体中代谢的米氏常数Km=6.8027μmol/L，最大代谢速率为Vmax=0.5476nmol/（mgprotein·min），肝清除率为CLint=0.008ml/（mg·min）。以往研究表明[4]，小檗碱在人肝微粒体中代谢的米氏常数Km=2.69μmol/L，最大代谢速率为Vmax=0.0252nmol/（mgprotein·min），肝清除率为CLint=0.0093ml/（mg·min）。两者在人肝微粒体中代谢有一定相似性。本实验研究甲氧沙林（CYP2A6），氟康唑（CYP2C19），α-萘黄酮（CYPlA2），奎宁（CYP2D6），酮康唑（CYP3A4），4-甲基吡唑（CYP2E1），磺胺苯吡唑（CYP2C9）7种专属抑制剂对黄连碱代谢的影响，研究结果表明，甲氧沙林、奎宁、酮康唑在一定程度上能抑制黄连碱的代谢，由此可推测CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4）参与黄连碱的代谢。通过黄连碱代谢产物测定发现，黄连碱在人肝微粒体中的代谢产物是黄连碱脱去一个亚甲基结构。本次研究为黄连碱药物相互作用和黄连碱在体内代谢情况研究提供重要参考。

参考文献：

[1]杨勇，叶小利，李学刚.4种黄连生物碱的抑菌作用[J]．时珍国医国药，2007，18（12）：3013

[2]陈柏年，于晓彦，孙加琳，等.黄连碱对L-NAME诱导高血压大鼠胸主动脉功能的影响[J].中国药理学通报，2011，27（5）：610.

[3]张志辉，邓安珺，于金倩，等.黄连碱药理活性研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（17）：2750-2754.

[4]陈健龙，张玉玲，董宇，等.小檗碱的酶反应动力学及其代谢酶表型和代谢产物研究[J].中草药，2013，13（44）：3334-3340．