钛颗粒刺激人血单个核细胞HMGB1、NF-?B、MIF表达的研究

钛颗粒刺激人血单个核细胞HMGB1、NF-?B、MIF表达的研究

何磊赵丽秦智敏赵静

何磊赵丽秦智敏赵静

邯郸市第一医院056002

摘要：目的观察钛颗粒刺激人血单个核细胞(peripheralbloodmonocytes,PBMC)表达HMGB1、MIF的情况，为临床防治膝关节置换术后无菌松动提供新的思路和方法。方法培养人血单个核细胞，用培养液、钛颗粒及LPS刺激，通过ELISA方法检测HMGB1、NF-?B和MIF表达。结果将分离得到的人血单个核细胞培养后分为3组，分别为空白对照组(PBMC+培养液)、钛颗粒组(0.1%钛颗粒+PBMC+培养液)、阳性对照组(LPS+PBMC+培养液)，观察24h后，采用ELISA方法测定HMGB1、NF-?B和MIF表达情况。采用SPSS13.0进行统计学分析，检验水准为?=0.05。结果HMGB1在钛颗粒刺激下表达6.73±0.19ng/ml，空白组表达为1.86±0.24ng/ml，两组对比差异有统计学意义（p=0.000<0.01），阳性组表达为7.51±0.32ng/ml，与钛颗粒组比较差异无统计学意义（p>0.05）；MIF在钛颗粒刺激下表达7.74±0.19ng/ml，空白组表达为3.93±0.11ng/ml，两组对比差异有统计学意义（p=0.000<0.01），阳性组表达为9.16±0.55ng/ml，与钛颗粒组比较差异无统计学意义（p>0.05）；NF-?B在钛颗粒刺激下表达18.76±1.15，空白组表达为9.57±1.38ng/ml，两组对比差异有统计学意义（p=0.02<0.05），阳性组表达为20.31±1.02ng/ml，与钛颗粒组比较差异无统计学意义（p>0.05）；结论钛颗粒刺激人血单个核细胞激活NF-?B通路，且HMGB1、MIF作为免疫炎性因子合成释放增多，参与膝关节置换术后关节无菌松动的发生发展。

关键词钛颗粒人血单个核细胞高迁移率族蛋白B1巨噬细胞移动抑制因子核转录因子

【中图分类号】R542.2【文献标识码】A

材料与方法

1.1主要试剂NF-?B、MIF、HMGB1的ELISA试剂盒（天津灏洋生物制品科技有限责任公司公司）；钛颗粒（美国AlfaAesar公司）用无菌PBS配制成浓度为0.05%、0.1%及1.0%的悬液。

1.2人血单个核细胞培养应用淋巴分离液和Percoll液进行梯度离心分离外周血单个核细胞，取0.5ml细胞样本进行细胞计数后，加入培养液（RPMI-1640：胎牛血清：抗菌液：左旋谷氨酸=100:10:1:1）。调整1ml培养液中含有1×106细胞。

1.3细胞活力（MTT）检测采用MTT比色法测定钛颗粒对细胞活力的影响，将细胞接种于96孔板（约5×104个/孔），分为4组：第1组不加钛颗粒，第2、3、4组分别加入浓度为0.05%、0.1%及1.0%的钛颗粒悬液。观察24h后，进行MTT检测。

1.4钛颗粒刺激后炎症因子蛋白情况检测将培养的人血单个核细胞按照1×106个/孔接种于24孔板，分为3组：第1组为阴性对照组（PBMC+培养液）、第2组为钛颗粒组（0.1%钛颗粒+PBMC+培养液）、第3组为阳性对照组（LPS+PBMC+培养液），培养24h，用ELISA方法检测HMGB1、NF-?B、MIF的表达。

1.5统计学方法统计分析采用SPSS13.0软件，用单因素方差分析方法，检验水准?=0.05，所有数据均使用（均数±标准差）表示。

2结果

2.1MTT检测结果空白对照组、不同浓度钛颗粒刺激组在24h时间点，细胞活性检测结果比较无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

注：a为钛颗粒组与空白组对比pa1=0.000<0.01,pa2=0.02<0.05,pa3=0.000<0.01;b为钛颗粒组与阳性组对比pb1>0.05,pb2>0.05,pb3>0.05

3.讨论

人工膝关节置换疗效的确切性及可预期性，使更多患者易于接受人工膝关节置换，人工关节的无菌性松动，是人工膝关节置换失败的最主要原因，目前防治人工膝关节置换松动是人工关节外科最重要的课题。

已有研究证实单核巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞等在人工关节磨损微粒刺激下产生大量炎性破骨细胞因子，导致假体周围骨溶解。其中巨噬细胞对磨损颗粒的吞噬所产生的一系列反应是最主要的原因，目前认为，巨噬细胞的数目与骨吸收的程度之间有着直接的关系。巨噬细胞活化导致骨溶解的生物学机制有两种，一是磨损颗粒刺激巨噬细胞，释放前炎症因子；二是磨损颗粒增强局部组织中的细胞浸润。可见，单核巨噬细胞对磨损颗粒的反应诱导了具有骨吸收活性介质的释放，这对人工关节无菌松动发生具有重要意义。进一步研究显示关节置换术后的假体磨损颗粒可通过不同的炎症信号传导通路上调炎症因子的表达。NF-?B通路是机体内多种炎症反应的共同通道之一，它主要通过调控炎症介质基因的转录来调控炎症性疾病的发生和发展，且可被多种因子激活，动物实验证实NF-?B通路可被钛颗粒激活，并上调免疫炎性因子如MIF、TNF-?等的表达[2]。本实验中对钛颗粒刺激人血单个核细胞合成释放NF-?B、MIF、HMGB1的研究结果显示，钛颗粒刺激PBMC后能使该细胞表达更多的NF-?B、MIF、HMGB1蛋白，说明在体外钛颗粒可诱导PBMC通过激活NF-?B通路上调MIF和HMGB1的表达。

MIF是重要的免疫炎症因子，在炎症级联反应中处于上游位置，能够上调其他炎症因子的合成和释放，从而调控各种炎症反应过程，其在多种炎症性疾病中均参与调控炎症反应。本实验显示0.1%钛颗粒刺激PBMC后，24h检测MIF蛋白的表达量增加(7.74±0.19ng/ml)，与空白组对比有统计学差异；HMGB1蛋白是一种晚期炎症因子，参与固有免疫和炎症的反应，可作为NF-?B的刺激剂，进一步活化NF-?B，造成持续的炎症反应并且放大炎症反应。本实验显示0.1%钛颗粒刺激PBMC后，24h检测HMGB1蛋白的表达量增加(6.73±0.19ng/ml)，与空白组对比有统计学差异；据以上结果说明MIF和HMGB1参与钛颗粒诱导的炎症反应，这些反应会促进假体周围骨溶解、吸收，导致假体松动。

据本实验结果可以说明当钛颗粒刺激PBMC后，首先是激活细胞的NF-?B通路，增加了MIF和HMGB1蛋白的合成和释放，促进假体周围炎症反应，导致假体无菌性松动。

参考文献

1.王钢,李亚明,刘世清等.人工关节磨损钛颗粒诱导破骨的NF-?B信号机制的实验研究[J].生物骨科材料与临床研究,2010,7(2):10-12

2.潘孝云,张先龙,毛昕,等.钛颗粒通过NF-?B信号通路上调炎症因子表达[J].浙江临床医学,2013,15(1):1-3.