一种新型微载体的制备及其细胞培养韦楚旭

一种新型微载体的制备及其细胞培养韦楚旭

韦楚旭

身份证号：445281198710203358510000

摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。由于精氨酸酸性羧酸酯基团，这个方案为细胞培养提供了与市售Cytodex1微载体相比具更低的表面pH，理论上表面pH值可以做到7.0左右，其结果是更适宜pH的微载体。将产物初步用于VERO细胞培养，得到了较好的结果。细胞在微载体上生长良好，和目前广泛使用的Cytodex1微载体效果相仿。

关键词：微载体、精氨酸、胍基、动物细胞培养

动物细胞培养常常需要贴壁生长，在悬浮状态下细胞生生长缓慢，停止，甚至死亡。微载体培养细胞原理是将对细胞无害的颗粒—微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使贴壁细胞在微载体表面附着生长，而同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。它将细胞的贴壁培养变为悬浮培养，这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度。精氨酸（以下简称Arg）可以算为一种双性氨基酸，因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电殛离开原位。这个胍基能形成多重的氢键。使其在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电。葡聚糖凝胶含有大量的羟基，且此羟基可被氧化成醛或酮或羧酸，适合作为微载体基体，利用这个性质，将精氨酸偶联在葡聚糖羟基上。

1、微载体制备

1.1微载体基体制备

1.1.1试剂规格：①葡聚糖（分子量为10000，分析纯）；②环氧氯丙烷（分析纯）；③Span80（分析纯）；④液体石蜡（分析纯）；⑤95%酒精（医用级）；⑥氢氧化钠（分析纯）

1.1.2制备方法：取50mL石蜡油加入100mL的烧杯中，然后放入水浴槽中，温度加热至50℃，开启搅拌，加入1mLspan80，搅拌10min后，等烧杯内温度达到50℃，加入10mL葡聚糖溶液（浓度为20%，10%氢氧化钠），继续搅拌20min，让葡聚糖溶液在石蜡油里面形成一个油包水体系，葡聚糖以小液球形式悬浮在石蜡油中，待乳化稳定后，加入3mL环氧氯丙烷交联固化，反应20min，然后将反应温度升至75℃，继续反应40min。然后取样观察载体固化程度，取1mL样品，加入10mL离心管中，然后加入5mL95%酒精，大力摇匀，然后静置2min，去除液体，如此方法重复3遍，最后得到脱水的载体，往试管加入5mL纯化水，摇匀2min，取样400倍显微镜下观察，固化好的载体经酒精脱水处理之后，再吸水膨胀恢复为无色透明光滑球体，载体无裂痕。固化完成后，停止加热和搅拌，静置，待载体沉淀后去除上清，加入100mL纯化水，开启搅拌，搅拌10min，然后停止搅拌，静置，待载体沉淀后去除上清；重复以上步骤清洗载体，直到石蜡油完全去除；并用筛网筛选其中150～250μm的微球，将筛选好的微载体加入5mL0.5mol/L的氢氧化钠溶液，密封保存待用。

1.2微载体修饰

1.2.1试剂规格：硫酸钠（分析纯），氢氧化钠（分析纯），硼氢化钠（分析纯），烯丙基缩水甘油醚（分析纯），乙酸（分析纯），醋酸钠（分析纯），L-精氨酸（BR级），饱和溴水（分析纯），甲酸钠（分析纯），酒精（95%，医用级）。

1.2.2制备方法：取10mL1.1制备好的微载体加入100mL的烧杯中，加入10mL纯化水和10.5g硫酸钠，以活化微载体凝胶上面的羟基，然后放入水浴槽，温度加热至30℃，开启搅拌，反应10min；然后加入5.4g氢氧化钠和1.9g硼氢化钠，然后将微载体加热至65℃，加入20mL烯丙基缩水甘油醚，在硼氢化钠的催化下烯丙基结合在羟基上，65℃下反应2小时，反应2小时后加入乙酸中和至pH6.5-7.5之间，以终止反应，接着用4倍体积的纯化水反复洗涤5次，再用3倍95%酒精洗涤5次，最后用6倍纯化水洗涤5次，最后沉淀去上清待用。将上面烯丙基化的微载体加入15mL水和0.25g醋酸钠，开启搅拌，然后加入2ml饱和溴水，反应继续进行5min，再加入HCOONa终止反应，搅拌反应30min，然后沉淀去除上清液。将上面的微载体加入5mL水和0.5g精氨酸，将反应温度加入至60℃，并用氢氧化钠溶液（10%，W/W）调pH至10.3，在30min和60min后测量pH值，并调至10.3，然后60℃下反应4个小时。待反应完成后，用乙酸将pH值调至6.5-7.5之间，静置10min，然后去除上清，接着依次用2倍体积的缓冲液（pH为8.0）和2倍体积的缓冲液（pH为4.0）洗涤，共8次循环，最后用8倍体积水洗涤。将洗涤好的载体加入玻璃瓶中，加入pH值为7.4的PBS缓冲液，121℃高温灭菌30min，常温密封保存待用。

2.细胞培养

2.1细胞株和培养基：采用非洲绿猴肾细胞（VERO细胞），培养基为DMEM，加10%胎牛血清、0.5g/L谷氨酰胺，0.2μm过滤除

2.2载体准备：分别各称1克市售GE的Cytodex1和Cytodex3干粉，分别置于100ml的烧杯中，加入50mlpH值为7.4的PBS缓冲液中溶胀1h，去除上清，再次加入50mlPBS浸泡1h，然后各取10ml微载体置于100ml搅拌瓶中；取10ml精氨酸微载体置于100ml搅拌瓶中。将以上3个搅拌瓶121℃灭菌待用。

2.3细胞培养：先将VERO细胞225方瓶中培养至致密单层，然后胰酶将方瓶中的细胞消化下来，平分3份，然后分别加入到3个带有微载体的搅拌瓶中，加入30ml培养基，置37℃培养箱中搅拌培养，搅拌转速为30r/min，逐日取样换液。

2.4细胞计数：取样1mL于10mL试管中，待多孔微载体沉降后用吸管尽可能多地吸出上清，尔后加入含0.1%结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液，使总体积至5mL，每隔1h用吸管吹打、摇荡，置于37℃下3h后，摇匀待微载体稍沉降后，用吸管紧靠液面吸取适量液体于血球计数板上，数出被染成深紫色的细胞数。

3.结果与讨论

3.1细胞在微载体上面的贴壁

接种细胞后，每间隔半小时取样一次，测定培养液内游离细胞浓度，用接种细胞浓度减去游离细胞浓度，即为贴附在微载体上的细胞。虽然培养初期，细胞在不同微载体上的贴壁速度不同，但随吋间的延长，细胞附着率逐渐接近，接种3小时后，细胞贴壁率均可达80%以上，12小时后，细胞全部附着在微载体上，培养基内无活的游离细胞存往。

3.2细胞在微载体上面生长

细胞贴附在微载体表面后，开始扩张生长，细胞浓度逐渐增大，没有附着在微载体上的细胞丧失活力。培养120小时后细胞浓度可达1.2X106个细胞/毫升，是接种细胞浓度的5倍。由于培养初期没有出现接种细胞损失现象，微载体浓度可以进一步增大，以获得更高的最终细胞浓度。接种24小时后，所有实验组的细胞贴附在微载体表面，扩展、附着倩况良好，细胞呈明显的纤维状。培养115小时后，精氨酸微载体实验组细胞在微载体上生长汇合形成致密的细胞单层，培养基内没有裸露的微戟体存在，细胞均匀地生长在所有微载体上。实验结果得出精氨酸微载体可提供的细胞数目明显高于市售微载体。

结束语：本论文提供了一种新型微载体的制备方法，按照本制备方法得到的微载体，实验结果表明在培养贴壁细胞上明显优于市售的微载体，同等密度下的微载体培养细胞可以得到更高数量的细胞数量。在实验过程中，仍然存在一些需要优化的地方，比如交联反应时反应温度、试剂加入量等参数的优化，耦合反应时各参数的优化，这些问题需要更进一步的探索。本文为贴壁型动物细胞用微载体提供一种新的合成方法。

参考文献：

[1]杨永新，李岩，孙殿甲.交联固化对明胶微球质量的影响[J].西北药学杂志.2011.

[2]张元兴，易小萍等.动物细胞培养工程[M].北京化学工业出版社.2006.

[3]R.I.Freshney.动物细胞培养基本技术和特殊应用指南[M].科学出版社.2014.