同种异体骨制备贮存的研究进展

同种异体骨制备贮存的研究进展

刘宏波李梦云田清业

刘宏波1李梦云2田清业1（通讯作者）

（1解放军第八十九医院全军创伤骨科研究所山东潍坊261045）

（2潍坊医学院山东潍坊261045）

【摘要】同种异体骨移植的应用日益广泛，其对解决骨缺损的难题有大的发展潜力。当今最常见的制备、贮存方法是深度冷冻和辐照灭菌，除此之外亦有其他多种方法，具有各自的优势。

【关键词】深冻骨冻干骨辐射灭菌同种异体骨

【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）03-0336-03

1880年苏格兰医生Macewen完成了历史上明确的第一例人同种异体骨移植。到现今骨移植已经成为人类除输血外,最常见的组织移植，自体骨对于年龄小的或者老年患者应用限制明显,而且增加了创伤部位、骨量来源有限、破坏供骨部位稳定。从而同种异体骨移植的应用日益广泛，其对解决骨缺损的难题有大的发展潜力。

1942年Inclan发表《库存骨在骨科的应用》,提出骨库的概念,随着骨库的建立,异体骨移植的研究和应用才逐渐活跃。1976年学术性机构美国组织库协会(Americanassociationoftissuebanks,AATB)的成立奠定了骨库发展的基础，从此同种异体骨移植步入了标准化发展的快车道[1]，欧洲在1991年成立了统一的欧洲组织库协会(EuropeanAssociationofTissueBanks,EATB)，并发表EATB标准[2]。现今骨库己成为现代骨科必须具有的一项设备[3]。随着供骨来源的增加和相关技术的进步，骨库在全世界逐渐普及。近年来，在美国计算机程序控制降温技术和营养保存液的合理配方已广泛应用，用于保存异体软骨的细胞，可以使其保持成活达4周之久，极大地方便了软骨组织的移植[4]。目前研究显示，小型骨库难以达到美国组织库协会和欧洲组织库协会的审核标准，不断被大型组织库兼并，在中国，骨库还处于发展阶段，有望在医学领域得到更好的发展[5]。

良好的骨库储存骨必须满足以下条件:1、成骨活性良好;2、免疫原性低;3、尽可能保存骨的生物力学特性;4、无菌。当今最常见的制备、贮存方法是深度冷冻和辐照灭菌，除此之外亦有其他多种方法。

1制备、贮存方法

1.1冻干

冻干骨是将新制成的深冻骨放入干燥机内，使骨组织内剩余水分降低到5%以下，然后进行无菌处理，放置在无菌真空容器内常温保存。冻干骨有常温保存便于运输成品、形状多样的优点。目前冻干骨已被看成是治疗骨缺损的良好材料[6]，已成为各国骨库的制备常规方法。但同时冻干骨由于脱水和显微裂纹,导致骨的力学特性发生改变,如骨脆性增加,抗扭和抗弯强度明显降低[7-9]。有数据显示冻干骨再水化后抗弯曲应力较新鲜骨减少了45%以上,抗旋转应力减少了61%。Simonian等[10]模拟临床上同种异体骨移植失败的模型,选用人的胫骨标本做螺钉拔出实验,发现冻干骨使螺钉拔出的力量明显减小,比正常对照组减小约1/3。因此对大段和需要承重的同种骨移植应该尽量使用未经冻干处理的骨。冰冻干燥法便于保存和运输,常用于制备骨钉、骨条等。

1.2深冻骨

制备：将获得的同种异体骨表面软组织、骨膜和骨端软骨彻底剔除,根据需要制成不同形状、大小的移植骨材料,使用无菌盐水或抗生素盐水进行加压冲洗，尽量去除骨髓组织,然后进行无菌包装,采用逐渐降温法,先将移植骨放人-4℃的冷库中,12h后再逐渐降至-80℃保存。在深低温(-80℃)状态下,酶的活性基本消失,酶对骨的破坏最小。通常用无菌塑料袋或纱布将植骨块包裹,贮存,以维持无菌性和减少水分蒸发。

深低温冷冻同种异体骨移植具有生物活性,保留了骨形态形成蛋白等成骨细胞因子的活性,可与受体发生生物结合,骨折易于愈合,免疫原性较低,不易产生排斥。一些研究显示,超深低温保存在降低骨的抗原性的同时，随着保存时间的延长骨的力学性能有细微的变化但还不致于影响临床使用，因此缩短超深低温保存时间有利于最大限度保留骨的力学特性[11]。Pereira[12]等对胫骨分别经过-70℃、-150℃冷冻并复温后测量其抗扭强度发现冷冻前后均无明显改变。Kang[13]等分别测量了牛胫骨条5次冻融后多个力学性能参数未发现明显改变。杨克强[14]等将深低温冷冻存储1年和7年的腓骨皮质测试其极限弯曲强度、极限压缩强度和弹性模量，发现1年和7年的腓骨皮质极限弯曲强度差异不显著。王金成[15]等从骨库骨的生物力学特性比较表明冷冻骨的抗压强度和最大应变值接近新鲜骨。Pelker[16]等将大鼠骨骼分别在-20℃、-70℃、-196℃3种不同温度下冷冻后测试长骨的抗扭强度没有发生改变。张朝春等[17]以SD大鼠为实验材料的研究中，发现在18d、180d、360d时冻融骨的压缩强度极限、压缩弹性模量、压缩率、变曲极限荷载等的主要力学指标无变化，但抗折能力下降，证明随着深低温保存时间的延长，骨的脆性增加。

同种异体骨的保存时间,一般认为在-70℃以下的环境中可保存1年以上,不致于引起异体骨生物性能降低,在-30℃以下低温环境中可保存半年[18]。

深低温冷冻技术降低带血管同种异体骨移植物的抗原性，移植后显著降低器官的移植排斥反应，有助于吻合血管通畅、移植骨的存活，加快骨连接。

深低温冷冻法对移植骨的生物学性能和生物力学特点无明显影响,是要求保留软骨活性的同种异体骨,关节保存的首选方法,同时也也适用于各种移植骨材料的保存。

1.3脱钙

脱钙法是将异种骨进行酸处理，脱去矿物质后留有非胶原蛋白、骨生长因子及胶原复合物，即成为脱钙骨基质（DBM）。国内外学者对骨移植材料进行了大量的研究,实验研究证实同种脱钙骨具有骨传导和骨诱导的双重作用[19]。国内外大量报道指出脱钙骨可以降低抗原性，促进骨诱导。骨中的钙盐对骨形态发生蛋白（BMP）有抑制作用[20-22]，脱钙有利于移植骨中BMP的释放增强其骨诱导作用，但是脱钙使骨中的无机质丢失严重影响骨移植材料的力学性能。Dziedic等[23]注意到脱钙骨存在强度降低和超前吸收的缺点复合冷冻干燥和高剂量辐照后更为严重。目前，研究较多的是复合脱钙骨，在各种促进成骨因素的作用下[24]，构建类似骨结构的组织工程骨。临床试验表明其骨腔充填的移植成功率在70%—85%[25],但对肢体大段骨缺损的疗效仍不满意。

1.4煮沸和高压蒸汽

煮沸法简单易行，能降低患者费用，较适合基层医院开展骨移植工作。能降低贮存异体骨的免疫性,但导致骨内酶的破坏,哈佛氏管发生凝固和骨胶原产生变形,损害血管生长,骨基质变性,骨愈合能力明显减弱。虽然理论上讲煮沸法同时也破坏了BMP，但有临床应用中却依然收到了满意效果[26]。

1.5常温骨保存液

国内外骨库储骨经验建立了常温骨库[27]在16℃的骨保存液中储骨,保存有新鲜骨、脱钙骨基质(DBM)、表面脱钙骨、半脱钙骨等人同种骨,并成功应用于临床,疗效满意[28]。

1.6-4℃恒温

新鲜骨的制备和移植，是将新鲜同种异体骨在-4℃下保存较短时间（<25天）后即用于临床移植有研究报道将异体骨在-4℃下分别保存14、21、28天，对比结果后发现，软骨厚度无显性著变化，细胞活性随保存时间的延长而略微减小，差异并不显著新鲜异体骨移植的最大特点是保留了骨的特性和软骨组织的成分，可与宿主骨快速整合修复，但新鲜异体骨来源极少，且术前处理十分繁琐复杂，可能会导致疾病传播和强烈的免疫反应，故目前已极少应用[29]。

1.7酒精浸泡

目前国内常用70%酒精、软骨保存液、1:1000硫柳酸汞配等来保存异体骨,而前者的效果较好。要求取骨后清除肌肉组织,放入1%新洁尔灭溶液中浸20min,然后放到70%酒精中浸泡,密封常温保存。每2个月换酒精一次,术前应做普通细菌培养3次,结果全为阴性方可使用[30]。70%酒精1min、30%酒精溶液5min、20%酒精溶液10min可灭活HIV[31]。

2灭菌方法

2.1射线

辐照灭菌是目前大多数组织库常使用的灭菌方法，目前常有的灭菌射线是γ射线。Mroz等[32]通过动物实验研究报道，在辐照计量<20kGy时，骨组织生物力学无明显改变，并能促进同种异体骨的骨传到和骨诱导性，是一种较好的灭菌方法。Greaves等[33]认为，低剂量γ射线（辐照剂量在14.6-18.0kGy时）照射时对胫骨移植物初始力学特性不产生负面影响总之，大剂量的γ射线照射可以破坏胶原分子之间的交联，使胶原纤维网状结构遭到破坏造成骨强度的下降，但常规灭菌剂量的辐照对骨移植材料的力学性能有无一定的影响仍然存在争议。在2005年，AATB同种异体骨移植材料的标准制备流程中：γ射线辐照灭菌已成为标准的制备流程。AATB建议辐照灭菌剂量应控制在15—25KGy[34]。

Campbell等[35]研究了γ射线和人类免疫缺陷病毒(HIV病毒)的相关性,发现89kGy才能完全灭活HIV病毒,这个剂量远远超过目前推荐使用的剂量。因此,取材要严格按照美国肌肉骨骼组织库协会颁布的要领，排除HIV和肝炎病毒等阳性供体并无菌制备。

2.2环氧乙烷（EO）

环氧乙烷(EO)是一种烷基化剂,通过使微生物中的核酸烷基化而灭活酶的活性从而达到灭菌效果。EO的有效浓度450—1500mg/L、湿度30%—60%、温度20—60e,经过2—5小时的熏蒸可完全杀灭各种细菌、病毒、芽孢。EO对移植骨的生物学特性有一定的影响,Thoren等[36]研究发现大剂量的EO气体会降低未脱钙移植骨的骨传导作用。Aspenberg等报道EO对脱钙移植骨的骨诱导作用有剂量依赖关系。但Tshamala等[37]的实验发现EO气体消毒对移植骨的骨诱导作用和骨传导作用没有明显影响,仅减慢移植骨的吸收速度。同时,因EO具有毒性,对受体周围组织有一定影响,可能会导致异体骨关节移植失败。尚且其穿透骨皮质的能力差,因而使用EO消毒移植骨逐渐减少,目前仅推荐颗粒状骨材料的消毒。

为了减少环氧乙烷的毒副作用以及降低其在骨组织内贮留,使用环氧乙烷对同种异体骨移植灭菌处理应重复换气,两周后再使用,手术中500ml生理盐水冲洗供体骨10min,以减少环氧乙烷残留浓度[38]。

2.3其他

B—丙内酯和硫柳汞由于具有较大的毒性,可致骨蛋白变性及组织结构发生改变,移植后感染率很高,穿透至骨的药物有致癌的可能。现已弃用。

Shimizu[39]采用过氧化氢气体源等离子体在45℃条件下对去脂肪冻干骨进行灭菌(低温等离子体灭菌),实验室和临床结果显示灭菌效果好,灭菌骨力学强度无损害,没有细胞毒性和环境污染,相对于环氧乙烷使用更为安全,但目前很少文献报道使用这一方法。

随着现代免疫学、生物材料学及相关高新技术的发展与应用，大量同种异体骨移植的相关研究已极大拓展了其临床应用范围。

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