慢性粒细胞白血病的实验室检查

慢性粒细胞白血病的实验室检查

韩保良

韩保良

安徽省六安市金安区妇幼保健院检验科安徽六安237000

摘要：目的通过实验室检测方法研究慢性粒细胞白血病（CML）各期中EG5mRNA的表达，并分析其与BCR/ABLmRNA二者在正常人骨髓与外周血中的表达相关性，对CML诊断以及预后评估中EG5mRNA的应用价值进行探讨。方法取62例慢粒病人外周血样本为本次研究对象，取8名健康志愿者骨髓以及外周血样本为参照，分别采用筑巢式逆转录聚合酶链反应（Nested-RT-PCR）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对其中的BCR/ABLmRNA和EG5mRNA的表达进行实验室检测。结果经检测发现，健康外周血中未发现EG5表达，而健康骨髓样本中则检测发现EG5存在低丰度表达；在CML辅助诊断中EG5具有的特异性以及敏感性依次为84.8%（28/33）、89.6%（26/29）；在CML诊断中BCR/ABLmRNA的特异性与敏感度则依次为90.9%（30/33）、96.5%（28/29），BCR/ABL与EG5在CML中的表达并无显著差异，不具有统计学意义（P＞0.05），但二者之间存在高度正相关。结论在慢粒疾病进展中，BCR/ABL与EG5二者表达情况基本趋于一致，对BCR/ABL与EG5进行动态观察和联合检测可辅助并支持CML临床诊断，同时还可作为CML患者临床疗效和预后的一项评估指标。

关键词：

慢性粒细胞白血病临床多称之为慢粒，属于多阶段疾病[1]。其中粒细胞为其优势增殖细胞系。诊断后慢粒患者生存期平均约为3~5a，其慢性期阶段历时较长[2]。CML实验室检测随着科学与医疗技术的不断发展而逐渐成熟，并由初始阶段的形态诊断逐渐发展至细胞遗传学诊断，其诊断分型至今已达到分子生物学水平[3]。本文分析了慢性粒细胞白血病（CML）各期中EG5mRNA的表达，并对其与BCR/ABLmRNA二者在正常人骨髓与外周血中的表达相关性展开研究，对CML诊断以及预后评估中EG5mRNA的应用价值进行探讨，现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料

取2009年7月~2012年12月期间在院接受治疗的CML病人62例为研究对象，本组患者病情均符合美、英、法协作组制订的CML诊断标准相符合，且经临床表现、骨髓象以及血象检测确诊。其中男35例，女27例，年龄9~69岁，平均年龄（35.8±4.22）岁。对其外周血进行血样采集；取同期健康志愿者8例为参照，其中男性6例，女2例，年龄22~37岁，平均年龄（31.8±2.55）岁，采集本组患者外周血和骨髓样本。

1.2检测方法

1.2.1引物

参照人体BCR/ABLmRNA、C-ABL、EG5mRNA序列以及融合基因断裂位点，采用DNA-Star以及Primerpreimer5设计引物，本次研究引物由上海生工公司提供。第一轮BCR/ABLPCR引物采用ABL-B以及BCR-A，第二轮则为ABL-D、BCR-C，其中b2a2型和b3a2型转录本产物分别为285bp、360bp。460bp为EG5PCR产物。

1.2.2合成cDNA

取RNA1μg，反应体系20μl中含有DNTPs1mmol/L、1×M-MuLVRTBuffer、40IU的RNAase抑制剂、200IUM-MuLV逆转录酶、随机引物1mmol/L，本组试剂均由Takara公司生产，42℃水浴处理，2h后保存于4℃环境下待用。

1.2.3EG5RT-PCR反应环境

在体积为23.5μl，含有1.5单位Taq酶、100μmol/LdNTP、2.5mmol/L氯化镁、5×PCRbuffer以及各100pmol/L上下游引物的反应体系中加入1.5ml逆转录产物，试剂由Takara公司提供，混匀后以石蜡封盖。实验循环条件为：分别在95℃、94℃、55℃、72℃环境下作5min、30s、45s、45s的预变性处理，循环次数为30。采用琼脂糖凝胶（10g/L）对10μlPCR产物进行电泳处理，在紫外线灯下对实验结果进行观察并摄像，产物表达强度采用GSM凝胶图像管理系统进行分析，结果判断标准参照β-actin随自身同时扩增的表达强度，样本相对表达量计算公式如下：表达强度（Relativevalue,RV）=样本灰度值/β-actin灰度值。

1.2.4Nested-RT-PCR反应环境

PCR反应体系体积为40μl，其中包括1.5单位Taq酶、200μmol/LdNTP、2.5mmol/L氯化镁、1×Tagbuffer以及各250pmol/L上下游引物。在反应体系中加入4ml逆转录产物，混匀后以石蜡封盖。循环条件为：分别在95℃、94℃、56℃、72℃环境下作5min、1min、1min、1min预变性处理，循环次数为30.取1μl第一轮产物接受第二轮PCR，反应条件参照首轮，但引物有所区别。采用琼脂糖凝胶（10g/L）对10μlPCR产物进行电泳处理，在紫外线灯下对实验结果进行观察并摄像。

1.3统计学分析

CML患者中29例病情处于初诊和进展期，33例则为完全缓解，采用SPSS18.0统计学软件处理本组研究数据，P＜0.05说明差异具有统计学意义。

2结果

经检测发现，健康外周血中未发现EG5表达，而健康骨髓样本中则检测发现EG5存在低丰度表达；在CML辅助诊断中EG5具有的特异性以及敏感性依次为84.8%（28/33）、89.6%（26/29）；在CML诊断中BCR/ABLmRNA的特异性与敏感度则依次为90.9%（30/33）、96.5%（28/29），BCR/ABL与EG5在CML中的表达并无显著差异，不具有统计学意义（P＞0.05），但二者之间存在高度正相关。

3讨论

经RNA芯片微阵列研究发现，EG5多在大部分增殖细胞中表达[4]，如原粒或者早幼粒细胞、骨髓CD34+、CD71+红系、721B淋巴细胞、burkitts淋巴瘤细胞等。本次研究在健康外周血中未发现EG5表达，而健康骨髓样本中则检测发现EG5存在低丰度表达，应为骨髓内部少量造血前体细胞仍存在一定增殖能力所致[5]，由此EG5表达情况可用于判定细胞增殖程度的一项有效指标。BCR/ABL酪氨酸激酶活性较强，容易导致基因出现复杂且广泛的表达异常，因而常被看做CML患者的分子病理基础，同时也是判断CML诊断、观察临床治疗效果以及监测微小残留病灶（MRD）的有效指标。本次研究中BCR/ABLmRNA的特异性与敏感度则依次为90.9%（30/33）、96.5%（28/29）基本与文献报道相一致[6]，而经统计分析发现BCR/ABL与EG5表达之间存在高度正相关，由此二者均可用于判断患者疾病进展程度以及观察临床治疗效果。

综上所述，在慢粒疾病进展中，BCR/ABL与EG5二者表达情况基本趋于一致，对BCR/ABL与EG5进行动态观察和联合检测可辅助并支持CML临床诊断，同时还可作为CML患者临床疗效和预后的一项评估指标。

参考文献：

[1]王志林,曹祥山,顾伟英等.一例der(22)缺失而存在der(9)的慢性粒细胞白血病的实验室分析[J].检验医学,2011,26(6):426-427.

[2]谭春艳,覃桂芳,曾维平等.骨髓和血液学指标在判断慢性粒细胞白血病患者预后中的作用[J].检验医学,2005,20(2):109-111.

[3]李扬秋,杨力建,陈少华等.TcellreceptorVβrepertoireusageandclonalexpansionofTcellsinchronicmyelogenousleukemia[J].中华医学杂志（英文版）,2004,117(6):840-843.

[4]LIYu-feng,DENGZhi-kui,XUANHeng-bao等.Prolongedchronicphaseinchronicmyelogenousleukemiaafterhomoharringtoninetherapy[J].中华医学杂志（英文版）,2009,122(12):1413-1417.

[5]吕晓东,范瑞华,胡杰英等.慢性粒细胞白血病Ph染色体和bcr-ablmRNA定量检测的临床意义[J].西安交通大学学报（医学版）,2010,31(3):325-327.

[6]HUShao-yan,CHENZi-xing,GUWei-ying等.HighexpressionofRbAp46geneinpatientswithacuteleukemiaorchronicmyelogenousleukemiainblastcrisis[J].中华医学杂志（英文版）,2005,118(15):1295-1298.

【作者信息】韩保良，男，1977.4，安徽六安，学士学位，主管检验师，主要从事血液检验方面的研究