荧光定量PCR技术检测结核杆菌临床应用

荧光定量PCR技术检测结核杆菌临床应用

钟福燕邝丽华

中山大学附属第三医院广东广州510000

摘要：目的：探讨荧光定量PCR技术检测结核杆菌的方法及应用。方法：建立检测结核杆菌的荧光定量PCR技术，并与培养法、涂片镜检法进行效果对比。结果：本方法检测结核杆菌具有较高的特异性、敏感性和重复性。对120例结核标本进行检查，荧光定量PCR法阳性率高达52.50%，培养法涂阳性率达24.17%，片镜检法阳性率达15.00%。结论：相对于传统的结核杆菌检查方法，荧光定量PCR技术具有高特异性，高敏感性等优势，对于结核病的诊断具有重要意义，值得临床推广应用。

关键词：荧光定量PCR；结核杆菌；检测

结核杆菌也叫做结核分枝杆菌，是结核病的致病菌。相关研究表明[1]，结核病以肺结核较常见，是一种严重的传染性疾病，根据世界卫生组织的报道，全球每年仍有近700万的新发病例，死亡200万人左右，我国目前大约有500万结核病患者，每年因结核病死亡大约20万人[2]，且发病率呈现出逐年上升的趋势。由于结核病危害大，及早的诊治就显得尤为重要，目前临床主要依据患者的病史，痰液、涂片抗酸染色等方法来进行诊断，但是误诊、漏诊的情况仍时有发生[3]。因此，寻找特异性高、敏感性高、简单实用的结核杆菌检测方法成为了研究热点。本文应用荧光定量PCR技术检测结核杆菌，进行了特异性、敏感性、重复性实验，并和传统的检测方法进行了比较，取得了较好的效果，现报道如下。

1.资料与方法

1.1研究对象

随机选取2016年2月至2018年2月在我院住院治疗的结核患者120例，其中，男性64人，女性56人，年龄28～78岁，平均（53±25）岁。所有入选患者均确诊为结核病，且自愿参加本次研究，签署有知情同意书。

1.2主要试剂仪器

质粒纯化试剂盒（L00420-50，金斯瑞生物科技），TaqDNA聚合酶（BG10101S，北京全式金生物），ExTaqDNA聚合酶，dNTPs（DBI-2055，北京鑫磊众森生物科技有限公司），Mx3000P实时荧光定量PCR仪（美国安捷伦）。

1.3研究方法

标本主要收集以上患者的晨痰5mL、外周血，胸膜炎患者的胸水等。所得标本先进行涂片抗酸染色以及结核菌培养来进行判断，再将所有标本严格按照《结核病诊断细菌学检查规程》[4]进行相关操作，然后进行标本编号，应用实时荧光定量PCR技术。

标本处理：痰液中加入3倍体积的4%氢氧化钠溶液，室温中液化半小时，取1mL离心15分钟，保留沉淀物，加入生理盐水1mL，混匀。胸水直接离心，取沉淀物。

1.4统计学方法

采用SPSS23.0统计软件包进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，两两比较采用t检验，组间比较应用方差分析，计数资料组间比较χ2检，P值＜0.05有统计学意义。

2结果

2.1特异性结果

选取了非结核分枝杆菌6株，各组探针FQ-PCR阴性；结核分枝杆菌标准株2株、卡介苗2株，FQ-PCR检测阳性。说明本方法对于结核分枝杆菌检测具有较高的特异性。

2.2敏感性结果

应用纯化的结核分枝杆菌标准株，经定量后，行荧光定量PCR扩增，结果显示，灵敏度为1pgDNA，1-5个菌体/mL。说明本方法对于结核分枝杆菌检测具有较高的敏感性。

2.3重复性结果

高浓度（3.5x104copies/mL）和低浓度（1.5x102copies/mL）的标本批内重复测定12次，CV分别为6.8%和7.1%，批间重复测定12次，CV分别为10.3%和11.2%。说明本方法具有较高的重复性。

2.4三种检查方法结果比较

应用三种方法对120例结核标本进行检查，荧光定量PCR法阳性63例，阳性率高达52.50%；培养法阳性29例，阳性率达24.17%；涂片镜检法阳性18例，阳性率达15.00%。具体结果见表1。

表1三种检查方法结果比较

3讨论

针对结核病的快速诊断是一个热门的研究方向，目前对于结核病的诊断主要依靠结核杆菌的分离培养，问题在于涂片法和培养法的效率不理想[5]，不能更好的满足临床需求。此外，还存在着检测阳性率不高，花费时间过长等缺点[6]。为了快速简单的检测结核杆菌，本文应用荧光定量PCR技术检测结核杆菌，进行了特异性、敏感性、重复性实验，并和传统的检测方法进行了比较。

研究结果显示，荧光定量PCR技术在特异性、敏感性、重复性方面均有较好的表现。在分别检测120份结核杆菌标本中，荧光定量PCR法检测阳性率高达52.50%，培养法检测阳性率达24.17%，涂片镜检法检测阳性率达15.00%，在阳性检测率方面荧光定量PCR法具有明显的优势。

综述所述，荧光定量PCR技术检测结核杆菌，方法可行，相对于传统检测方法具有较大优势，值得推广应用。

参考文献：

[1]姜晚云.荧光定量PCR技术在结核杆菌检测中的应用[J].中外医学研究，2014，12（14）：65-66.

[2]王雅宁.荧光定量PCR技术检测结核杆菌临床应用分析[J].实用预防医学，2015，19（09）：1404-1406.

[3]ZhongN，WangC，YaoW，etal.PrevalenceofchronicobstructivePu-lmonarydiseaseinChina：alarge，population-basedsurvey.AmJＲespirCriCareMed，2017，176：753-760．

[4]崔金环，杨光，苏锡康，郑会洁，李晓杰，曾劲伟.荧光定量PCR技术检测石蜡包埋组织结核杆菌DNA的应用评价[J].广东医学，2014，32（20）：2695-2697.

[5]邬艳.荧光定量PCR检测痰结核杆菌特异性DNA序列及其临床应用[J].中外医学研究，2016，10（16）：65-66.

[6]JanssensW，BouillonＲ，ClaesB，etal.VitaminDdeficiencyishighlyprevalentinCOPDandcorrelateswithvariantsinthevitaminD-bindinggene［J］.Thorax，2016，65（3）：215-220．