实时荧光定量 PCR 技术原理与应用研究

实时荧光定量 PCR 技术原理与应用研究

张典 1 夏乐天

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江苏徐州，徐州医科大学医学技术学院，221000；2.江苏徐州，徐州医科大学附属医院检验科，221000

【摘要】：实时荧光定量 PCR 技术是普通聚合酶链式反应技术基础上演变起来，一种灵敏度较高的核算定量技术。与常规 PCR 相比，它的不同之处在于其根据PCR产物中莹光信号的强度定量, 不仅提高了反应的特异性和自动化程度，而且有效解决 PCR 污染等问题，实现了检测质量的飞跃.当前已经被广泛应用于医学诊断和环境监测多种领域的研究，本文对实时荧光定量PCR的原理，分类以及应用做一系统性综述。

【关键词】：实时荧光定量PCR；原理；应用；

*：通讯作者

通讯作者：李洪春，主任技师，徐州医科大学附属医院检验科，221000.

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是分子生物学领域中一种常规的实验方法，目前被广泛应用在病原菌的检测和疾病的诊断等方面。由于传统的PCR技术在基因定量方面的缺陷^[1]，实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent quantitative PCR，RQ-PCR）技术在1996年被推出。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且它的简单性、特异性和敏感性，以及它对高通量的潜力和新科学的持续引进，有望使实时荧光定量PCR成为检测基因水平的基准技术^[3]。

1.实时荧光定量技术的基本原理

实时定量 PCR 技术，与传统的PCR技术相比基本原理是相同的， 主要不同之处是其定量的体系。在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光基团， 这些荧光物质有其特定的波长。仪器能够自动检出，通过荧光信号实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个Ct值 (Threshold Cycle) 概念，Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数 ，是PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。通常标准曲线由不同浓度的标准品的Ct值绘制而来， 然后计算相对方程式。在标准曲线的线性回归具有高相关系数（R2>0.99）的基础上,利用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量 PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

2.实时荧光定量的技术分类

通常根据实时荧光定量PCR所用的荧光模式不同，RQ-PCR方法分为荧光染料法和荧光探针法2种[4]。

2.1荧光染料法

荧光染料法是在PCR体系中加入荧光染料，荧光染料能非特异性的结合到 DNA双链的小沟中，目的基因的定量是通过荧光信号的积累监测监测荧光信号反应进行。SYBR Green1 是应用最广泛的一种荧光染料，因成本低廉被普遍应用于各种分子生物学实验研究，但对PCR有一定的抑制性，而且荧光强度低，稳定性差，针对其存在的缺点，一些新兴的燃料被开发，如SYBR Green ER、Eva Green TM、Pico Green等。其中Eva Green是替代SYBR Green的第三代燃料，与双链DNA分子的结合更稳定，对PCR反映的抑制程度比非饱和的SYBR Green燃料更小。Pico Green是作为一种新型燃料，不仅具有较高的灵敏度，而且其线性范围广，受其他物质影响小，可以检测出至少25pg.ml-1的dsDNA分子。

2.2荧光探针法

荧光探针法是通过使用探针与与目的DNA片段特异性杂交，对PCR扩增产物进行定量指示，由于其具有高特异性、可靠性和实验结果高度稳定等诸多优点，目前主要用于专一序列的DNA检测。根据荧光基团标记和共振能量转移的方式，主要分为水解探针和杂交探针，典型的水解探针包括TaqManTM 探针和TaqMan MGB探针，杂交探针有双杂交探针、分子信标和荧光标记引物 / 探针等 。

3.实时荧光定量的应用

3.1实时荧光定量技术在食品检测中的应用

随着食品质量安全监管部门的检测技术不断完善，食品掺假的手段也在不断提高，越来越多的生产商通过以次充好以及添加大量食品添加剂来谋取暴利。RQ-PCR已经在广泛用于检测食品中掺杂成分的实践研究中来，运用免疫学技术确定其源性成分^[4]。周彤等人在利用RQ-PCR检测食物中的鸭源性成分，其灵敏度达到 0.1μg / kg 的较高水平，并且羊肉成分对其不产生影响，为打击食品的掺假制假行为提供了良好的技术支持^[5]。

3.2实时荧光定量技术在植物中的应用

植物抗性基因的研究已经成为科学家们研究的热点和焦点问题，传统实验方法无法实现对该基因的表达量差异做出准确和快速分析，而RQ－PCR 技术能够实现检测在不同处理条件下表达量的差异。对植物进行加工处理后检测疑似抗性基因与内参基因的表达量，而其基因的表达量的确定就是将样品的Ct值代入标准曲线计算而来的。最后利用疑似抗性基因和内参基因的相对浓度的比值来计算疑似抗性基因相对表达水平，从而确定其是否为抗性基因。

3.3实时荧光定量技术在医学领域的应用

3.3.1对病原 DNA 的检测

利用实时荧光PCR检测病原DNA的过程中不仅可以确定病原DNA的性质,还能够对病原含量做出定量检测，为临床诊断提供了强有力的依据。如今实时荧光定量PCR已经应用于检测多种病原体,包括乙型肝炎病毒 DNA、猪内生逆转录酶病毒，EB病毒等。

3.3.2染色体病和基因病的诊断

过去人们对染色体病的诊断, 主要依靠在细胞水平的染色体核型分析,该法不仅耗时较长，而且易对妊娠晚期的孕妇产生不利的影响。诊断单基因病时，大片段基因的缺失能够经过设计跨基因片段的荧光探针基因, 然后对其扩增。若有基因缺失,将无荧光的产生。

3.3.4 药效考核

实时荧光定量PCR还可用于使用某种基因型疾病药物治疗后的疗效检测对，对相关基因是否转录或转录量的多少均可以快速准确的监控。范瑞强等人在利用荧光定量PCR技术研究中药抗病毒胶囊对豚鼠HSV-2系统感染的影响中观察到，在各组动物中，不同部位均有病毒DNA的存在和不同组之间相应部位也存在差异，其中与生理盐水组相对应的各个部位相对比，中药抗病毒组病毒拷贝量有显著差异。

3.3.5肿瘤研究

尽管说肿瘤发生的相关分子机制尚未完全阐明,但是研究者们普遍认为相关基因的遗传学改变累积是致癌性转变的根本因素。在很多肿瘤发生的早期和良性阶段，癌基因就会出现突变和表达增多，RQ-PCR不单能够有效地预测基因的突变，并且能够准确的测定表达量，根据这些特性可以对肿瘤进行早期诊断、分类、分期以及预后判断。

3.4环境污染

环境中存在着多种微生物，其中不乏一些对人体有致病性的菌种。近年来人们对于工作，生活以及居家环境安全的重视，环境中微生物含量是否超标也逐渐走进人们的视野。现如今，RQ-PCR已经广泛应用于生活环境中大肠杆菌、施氏假单胞菌以及土壤中炭疽芽孢杆菌，水体中蓝细菌及一些寄生虫等的鉴定和定量检测。有研究表明在赤潮发生早期，实时荧光定量PCR技术比传统形态学观察相比更易发现圆海链藻，能够为赤潮的预测和防治提供准确的数据。

References

[1] 李金明. 聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性. 中华检验医学杂志. 2005. (03): 5-7.

[2] 鲍鑫, 刘向国, 刘茜. 实时荧光定量PCR技术研究及其在医学领域的应用. 医学理论与实践. 2013. 26(12): 1579-1580+1583.

[3] 栗文凯, 张智勇, 胡建和, 李军. 实时荧光定量PCR应用技术综述. 中国畜禽种业. 2008. (19): 71-72.

[4] 程海星, 郭月英, 任霆等. 实时荧光定量PCR技术原理及在食品检测中的应用. 食品与发酵工业. 2015. 41(03): 243-247.

[5] 周彤, 李家鹏, 田寒友, 杨君娜, 邹昊, 乔晓玲. 一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定. 肉类研究. 2013. 27(12): 11-15.