金属蛋白硫在体外受精-胚胎移植胎盘及胚胎组织中表达及意义

金属蛋白硫在体外受精 -胚胎移植胎盘及胚胎组织中表达及意义

谢松波

吉林大学基础医学院 邮编 130021

摘要：目的研究辅助生殖中体外受精一胚胎移植(IVF—ET)技术本身对早期胎盘绒毛和胚胎组织中金属蛋白硫及其基因表达影响。方法 收集辅助生殖IVF—ET来源，双胚胎移植妊娠45～60天，经超声引导下减胎获得胎盘绒毛和胚胎组织各8例，作为研究组，对照组采用自然妊娠双胎45～60天人工流产中获得的胎盘绒毛和胚胎组织各10例。从采用免疫组织化学方法和实时荧光定量RT—PCR方法检测组织中金属蛋白硫蛋白和mRNA的表达及分布差异。结果 表达部位：金属蛋白硫表达于胎盘绒毛细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞的细胞膜和细胞质，广泛表达于胚胎各个胚层。表达特点：IVF—ET来源胎盘绒毛组织中金属蛋白硫表达的吸光度值显著低于自然妊娠组，差异有统计学意义。金属蛋白硫在IVF—ET和自然妊娠胚胎组织中表达比较，差异无统计学意义。基因表达：金属蛋白硫mRNA在IVF—ET胎盘绒毛组织中低表达，而在胚胎组织中表达比较，差异无统计学意义，与免疫组织化学结果相一致。结论 金属蛋白硫蛋白和基因IVF—ET胎盘绒毛组织中表达低于自然妊娠组织，而在胚胎组织中表达比较，差异无统计学意义，显示IVF—ET技术本身更加倾向于影响胎盘发育和功能，金属蛋白硫可能在IVF—ET相关疾病发病机制中发挥作用。

关键词：金属蛋白硫；体外受精；胚胎移植；胎盘胚胎

金属蛋白硫是一种富含半胱氨酸的低分子量蛋白质。 其基因位于16号染色体q13区，主要位于细胞核，线粒体，内质网等细胞器中。 对早期胚胎和胎盘发育具有重要意义。 具有重要作用。 本文探讨IVF-ET技术对该基因表达和功能的影响，从胎盘和早期胚胎发育的角度探讨辅助生殖的安全性和不良妊娠结局的可能病理生理机制。

1资料和方法

1.1一般资料

选取2014～2017年在北京大学第三医院生殖中心因为输卵管因素或者男性因素接受IVF—ET治疗患者，患者均是在新鲜周期取卵移植，因双胎妊娠减为单胎102例孕妇，选择其中IVF—ET移植术后双胎减胎的8例组织标本作为研究组(患者年龄23～35岁，平均年龄30．8岁)。102例患者双胎减为单胎的原因为：高血压等慢性疾病、子宫畸形、瘢痕子宫、子宫平滑肌瘤、宫颈机能不全、宫颈癌锥形切除病史或者患者要求。所有减胎术均由同一位高年资妇产科医生在阴道B超引导下施行，通过物理抽吸方法获得胚胎和胎盘绒毛组织，术前和术中不使

用任何药物和激素。于胚胎移植后30～45天施行减胎术，相当于妊娠45～60天。对照组采用非计划妊娠10例(年龄24～30岁，平均年龄28．9岁)，所有患

者月经规律，近3个月未使用激素类药物，经早孕实验和B超诊断宫内妊娠，胚胎和胎盘绒毛组织采用传统人工流产获得。

1.2减胎体外受精一胚胎移植(IVF—ET)标本获取

超声监测下阴道探头频率为6。置5MHz，排空膀胱，取膀胱截石位，悬垂常规消毒，放置装有无菌探针盖的穿刺针导针的阴道探头，了解孕囊的大小，位置及关系，使用16G双腔穿刺针，沿超声穿刺导线插入针头，穿刺导针及子宫壁刺入人胚体，助手使用20ml注射器抽吸胚胎组织，观察胚胎组织抽吸或残胚.胎儿心脏跳动后，取出穿刺针时，胎盘绒毛组织被吸在胚胎和子宫内膜的交界处。 立即置于热期倒置显微镜下分离除去血液，胚胎组织等杂质，纯化胎盘绒毛，立即送少量胚胎和绒毛组织到细胞遗传学实验室进行核型检测，正常染色体组织可用于后续研究。 常规流产用于自然妊娠，少量胚胎和胎盘绒毛组织也被送到细胞遗传学实验室进行核型检测。 术前不使用米索和激素。

1.3胚胎和胎盘绒毛组织处理

胎盘和绒毛组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗，然后放置在10%甲醛溶液中，在4cc中固定16h，用PBS多次冲洗，50%、70%、95%和无水乙醇脱水。 与二甲苯透明。 将蜡在58°C下浸泡过夜，更换石蜡后继续浸泡4小时，再进行包埋。 将嵌入的蜡块放入4。 储存于冰箱C中，以备以后使用。 采用徕卡RM2135石蜡微体进行切片，厚度为6厘米，切片显示在载玻片42上。 丙烤4天，然后在4处密闭存放。 正在测试C型冰箱。

1.4免疫组织化学

石蜡切片在室温下平衡后，二甲苯脱蜡，用无水乙醇、95%、70%和50%水化后，用蒸馏水洗涤切片。 在柠檬酸盐缓冲液95中。 微波热修复15分钟暴露抗原。 冷却至室温后，1%H：O：在室温下孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。 进行PBA清洗，5%BSA阻断30分钟。 小鼠抗人AFP抗体（中山市金桥生物公司，1：400稀释）4。 一夜之间孵化。 第二天用PBS洗涤，用辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG（中山金桥生物公司，1：100稀释）室温孵育15分钟。 用PBS洗涤，用二氨基联苯胺（美国达科）显色10分钟，用自来水冲洗，停止显色反应。 苏木素反染色10s，用自来水冲洗。 经过乙醇逐步脱水，二甲苯是透明的，幻灯片安装，加拿大树胶封片。

1.5免疫组织化学结果判定

采用日本ECLIPSE80i专业图像采集分析系统（日本尼康公司)对免疫组化切片进行半定量分析）。 在相同条件下观察和收集同一批染色切片的图像。 使用NIS-Elements3.0软件测定采集图像中阳性部分的吸光度(A)值（细胞核和细胞质中的棕色颗粒呈阳性表达），在400x光学显微镜下随机选取胎盘绒毛和胚胎组织切片5个表皮部分，计算阳性表达的平均吸光度(A)。

1.6qRT—PCR检测

采用QRT-PCR方法检测胎盘绒毛和胚胎组织的基因表达。 第一链互补合成反应使用Prime Script反转录试剂盒（大连宝生物工程大连有限公司。）。 用于扩增反应的QRT-PCR仪器PRISM7300(美国ABI公司)，GAPD H内参，QRT-PCR检测金属蛋白硫引物为5‘-ACTGCTCCTGCGCCATGG-3’，5‘-ATTATCATTCACATTTCAT-3’，GAPD H引物为5’-AAGCCATCATCTCCAG-3’，5’-TCT。 gggg a-37。 每个qRT-PCR反应建立3个复合物，重复3次，用DDCt法分析结果。

1.7统计学方法

采用统计学软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差表示，样本均数问比较采用t检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

2结果

2.1金属蛋白硫在胎盘组织中表达

金属蛋白硫在早孕胎盘绒毛组织的细胞滋养细胞、合胞滋养细胞和细胞滋养细胞柱中表达。 其中，合胞滋养细胞的表达高于IVF-ET组和自然妊娠组。 细胞滋养细胞。 来源于IVF-ET的胎盘绒毛组织中金属蛋白硫表达的吸光度(A)值为0.036±0.004，来源于天然妊娠的胎盘绒毛组织表达较强，吸光度(A)值为0.040±0.004。 体外受精-ET组胎盘绒毛组织中金属蛋白硫的表达低于自然妊娠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 金属蛋白硫在早期胎盘绒毛组织中表达情况

2.2金属蛋白硫在胚胎组织中表达

金属蛋白硫在IVF—ET组和自然妊娠早期胚胎组织中具有广泛表达，其中IVF—ET组和自然妊娠组胚胎组织中金属蛋白硫表达比较，差异无统计学意义(P>0．05)，见图2。

图2 金属蛋白硫在早期胚胎组织中表达情况

2.3qRT—PCR检测结果

qRT—PCR检测金属蛋白硫mRNA在早孕胎盘绒毛和胚胎组织中表达，结果显示，IVF—ET胎盘绒毛组织中金属蛋白硫mRNA低于自然妊娠组，差异有统计学意义(P<0．05)。IVF—ET组和自然妊娠组胚胎组织中，金属蛋白硫mRNA表达差异无统计学意义(P>0．05)。

3讨论

本研究分析了IVF-ET在胎盘绒毛和胚胎组织中的金属蛋白硫基因和蛋白表达。 与自然妊娠相比，IVF-ET胎盘绒毛中金属蛋白硫含量较低，而IVF-ET胚胎组织中金属蛋白硫的表达无显着性差异。 定量RT-PCR结果表明，金属蛋白硫基因IVF-ET组胎盘绒毛的表达低于对照组。 IVF-ET胚胎组织与对照组无统计学差异。 化研究成果一致。 金属蛋白硫是胎盘内的内源性抗损伤物质。作为一种多功能蛋白，其功能包括重金属的解毒，必需金属元素的平衡调节，稳定细胞膜，清除自由基，抑制脂质过氧化，减少钙超载和DNA损伤保护，与血管生成，细胞存活，凋亡和增殖有关。 本研究发现，与自然妊娠相比，IVF-ET早期胎盘滋养层细胞金属蛋白硫的表达较低，说明IVF-ET技术操作或药物影响胎盘滋养层细胞的早期发育和功能，干扰金属蛋白硫的表达，进而多个功能方面影响滋养层细胞的功能。 本研究结果表明，IVF-ET技术影响胎盘组织的锌稳态，进而影响其功能。 金属蛋白硫对重金属有解毒作用。 其特殊的分子结构和金属亲和力使其能够结合有毒的游离金属离子，缓解重金属毒性，并将金属离子输送到肝肾器官进行解毒和消除。

此外，本研究发现金属蛋白硫在早期IVF-ET胎盘组织中在细胞滋养细胞和合胞滋养细胞中的表达较低，其基因表达通过qRT-PCR验证与组织化学结果一致。 与自然妊娠组相比，IVF-ET组胎盘绒毛组织中金属蛋白硫的表达较低。 体外受精-ET组与自然妊娠组胚胎组织中金属蛋白硫蛋白和基因表达无统计学意义。 研究结果表明，与胚胎相比，辅助生殖技术倾向于影响胎盘功能，这与动物模型研究的结果一致。

综上所述，胎盘作为妊娠期重要的多功能器官，可能是辅助生殖过程中多种影响因素的靶器官。 对人类辅助生殖早期胎盘中滋养层细胞功能的深入，全面，系统的研究，阐明了胎盘功能变化的病理生理过程和分子机制，探索干预措施提高辅助生殖技术的安全性。

参考文献：

[1]赵亮, 张晗, 孙丽芳,等. 金属蛋白硫在体外受精-胚胎移植胎盘及胚胎组织中表达及意义[J]. 医学研究杂志, 2019, 48(004):20-24.

[2]郑秀丽, 刘静芳, 郑蓉,等. GCM1在体外受精-胚胎移植胎盘及胚胎组织中表达及意义[J]. 中国优生与遗传杂志, 2019,16(10):186-187.