酚类降解菌的筛选及作用效果的研究

酚类降解菌的筛选及作用效果的研究

王其辉 郝景雯 曹琳琳

天津市工业微生物企业重点实验室

针对含酚工业废水，采用原位分离技术从其生物系统中分离得到好氧菌7株，兼氧菌4株，并利用16SrDNA测序方法进行了鉴定，经进一步筛选确定由蜡样芽胞杆菌、腐败希瓦氏菌等4株菌复配成好氧菌剂，贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等3株菌组成兼氧菌剂。以预处理后的含酚废水为目标，采用48小时酸化水解，72小时好氧曝气处理后，经菌剂降解性能的验证实验，结果表明：所研制的复配菌剂与原位样直接增值的培养液，无论是废水COD降解率，还是酚类物质降解率水平相当，说明研制的菌剂可以强化活性污泥。

关键字：原位分离 含酚废水 强化污泥 高效降解

Seven strains of aerobic bacteria and four strains of facultative bacteria were isolated from the biological system of phenol containing industrial wastewater by in-situ separation technology, and were identified by 16S rDNA sequencing method. After further screening, it was determined that four strains of Bacillus cereus, Shigella putrefaciens and three strains of Bacillus belies and Bacillus pumilus were combined to form an aerobic agent. After 48 hours of acidification and hydrolysis, 72 hours of aerobic aeration treatment, the degradation performance of the microbial agent was verified. The results showed that the degradation rate of COD and phenols in the wastewater of the compound microbial agent was equivalent to that of the in-situ sample, indicating that the developed microbial agent could strengthen the activated sludge.

keyword: In situ separation，Phenolic wastewater，Enhanced sludge，Efficient degradation

高效降解酚类物质微生物菌种的筛选是生物降解含酚工业废水的技术核心，原位分离技术是一种快速分离和筛选目标微生物的有效途径，由于长期自然驯化的原因，原位分离得到的微生物具有环境适应能力强、共生关系稳定和底物降解针对性好等特点，是一种值得推广的有效方法。本文以四溴双酚A（TBBPA）废水为例叙述分离筛选的过程。

1.酚类降解菌的筛选

1.1利用原位分离技术筛选酚类降解菌

原位分离原理：TBBPA废水对一般微生物具有较强的毒害作用，且可生化性很差，但研究中发现该废水中仍有一定数量的微生物，说明能够在TBBPA废水中存活下来的微生物是经该环境长期自然驯化的结果，这些微生物对该恶劣环境具有很强的适应性，并能够诱导产生一系列酚类水解酶，以这些酚类污染物为营养生活在其中，原位分离正是在这一原理指导下进行的。

以TBBPA废水为分离源，采用传代增殖培养技术，将目标微生物增殖，再利用适当的培养基将其分离出来，得到单纯菌种。

1.2 废水水样和泥样来源

来自汉沽某公司含酚废水处理装置的生化系统中，选取不同位置的水样和活性污泥样。

1.3菌种的增殖培养、驯化与分离

增殖（富集）培养基：牛肉膏1g，蛋白胨3g，TBBPA废水1000mL，pH 7.0；121℃，灭菌20 min，冷却备用。

按10%接种量接入废水水样（或泥样），37℃、静置或160rpm振荡培养24h；重复以上操作，连续培养驯化5代。

菌种分离：将连续驯化5代后的培养物进行梯度稀释，选适当稀释度，吸取0.5ml涂布于预先准备好的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，32℃条件下，倒置培养36 h。待长出单菌落后逐一标记，并挑入牛肉膏蛋白胨斜面，于32℃条件下，静置培养48 h。

1.4初筛结果

将初筛出的菌种进行编号，其中好氧菌种9支、兼性厌氧菌种7支，分别为：X1～X9、Y1～Y7。

2.初筛菌种的鉴定

通过对初筛菌种的鉴定，了解生物处理系统（厌氧和好氧）微生物的分布情况，确定系统中处于优势的微生物种类，为优势菌种的选择及优势菌种的复配提供参考依据。同时，深入了解酚类降解微生物的种类及特点，为环境微生物菌种开发与档案的建立奠定基础。

本项目利用16S rDNA扩增子测序技术研究生物系统中主要微生物群落的组成情况。该方法是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，所代表的信息量适中，因此是进行分类研究的理想材料。利用 16S rDNA 两端的引物 PCR 扩增未知菌株的 16S rRNA 基因，并进行 DNA 测序，再与基因库中的已知序列进行同源性比对，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物如图2-1、2-2所示。

图2-1 菌X1-X9琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图

Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7

图2-2 菌Y1-Y7琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图

鉴定结果：

根据上述菌种鉴定结果，去掉重复的菌株，最后得到好氧菌7株，兼性厌氧菌4株，内部命名为：Triim001-011，其中Triim001-0007为好氧菌，Triim008-011为兼性厌氧菌，见表2-1所示。

表2-1 TBBPA废水中分离得到的菌株

3.复合菌剂的研制

3.1菌剂的复配

考虑到复合菌剂生产的实际情况，依据分离得到的各菌株在生物处理系统中的分布比例，确定好氧复合菌剂BS1由：Triim001、Triim002、Triim003、Triim005四种组成；兼性厌氧菌复合菌剂BS2由：Triim009、Triim010、Triim011三种组成。

3.2复合菌剂降解性能的验证

为了进一步验证复合菌剂对酚类物质的降解效果，我们首先对废水样中微生物进行增殖培养，并以此（称增殖液）为对照，开展含酚废水的降解实验，以观察和确定复合菌剂的使用效果。

⑴ 增殖培养步骤：取生化系统的废水样，以10%添加量接入肉汤培养基，兼氧菌采用静置培养，好氧菌采用振荡培养，摇床转速160rpm，32℃、培养24h，得到菌液A1（兼氧）和A2（好氧）；

⑵ 菌剂配制步骤：取筛选的好氧菌种Triim001、Triim002、Triim003、Triim005，以2%的接种量分别接入肉汤培养基中，32℃、振荡培养24h，摇床转速160rpm，培养后按3:2:2:3比例复配得到菌液A1（好氧）；再取筛选的兼氧菌Triim009、Triim010、Triim011，以2%的接种量分别接入肉汤培养基中，32℃、静置培养24h，培养后按4:3.5:2.5比例复配得到菌液A2（兼氧）。

⑶ 活性污泥的生物强化：取四个2000mL量筒，分别按30%添加活性污泥，再将A1和A2两种菌液分别按污泥量10%对应加到量筒中，与活性污泥混合均匀，最后向量筒中加入一定浓度的TBBPA废水，对污泥进行浓度梯度驯化，逐步加大TBBPA废水浓度，驯化时间7-10天，得到驯化好的强化活性污泥，分别用C_H菌剂和C_Y菌剂表示好氧和兼氧两种强化污泥。另外，将好氧和兼氧污泥分别接种到增殖培养基中，培养得到两种污泥增殖液，用B1和B2表示。用B1、B2分别替代A1、A2，同样方法进行污泥驯化，用C_H增殖和C_Y增殖表示两种增殖污泥备用。

⑷ 降解性能的验证与比较：取500mL量筒2个，分别添加兼氧污泥C_Y增殖和C_Y菌剂各125mL，再加入375mL TBBPA废水，间歇搅拌处理72h，转速50rpm，将处理后废水静置、取上清液备用；另取500mL三角瓶2个，分别添加好氧污泥C_H增殖和C_H菌剂各50mL，再加入150mL 兼氧处理后的上清液，振荡培养48h，摇床转速160rpm，培养后静置沉淀，取上清液过滤。分别以TBBPA和COD为指标进行分析测定，结果见表3-1。

表3-1 复合菌剂对含酚物质的降解性比较

通过上述降解性能比较实验，可以看出：从两者对含酚废水降解效果来看，复合微生物菌剂与对照相比，无论是水体中TBBPA含量的减少，还是COD下降情况，水平基本是相当的，说明复合微生物菌剂可以起到强化活性污泥作用、能够有效降解酚类物质。

3.3菌种的培养与菌剂的制备

1. 好氧菌的培养：

好氧菌剂由蜡样芽孢杆菌（Triim001）、腐败希瓦氏菌（Triim002）、杀鲑气单胞菌（Triim003）和施氏假单胞菌（Triim005）四种组成。统一采用肉汤培养基，pH7.0-7.2，振荡或通风培养条件如下表3-2：

表3-2 好氧菌剂的培养条件

2、兼氧菌的培养：

兼氧菌剂由贝莱斯芽孢杆菌（Triim009）、短小芽孢杆菌（Triim010）和类芽孢杆菌（Triim011）三种组成。统一采用肉汤培养基，pH7.0-7.2，培养条件如下表3-3：

表3-3 兼氧菌剂的培养条件

3、菌剂的制备

经上述条件培养的各菌株，经检测菌体浓度达到10⁸cel/ml以上。