柯萨奇病毒A组4型的研究进展

柯萨奇病毒 A组 4型的研究进展

黄思静 1#、龙入川 1#、刘启亮 1、何韵怡 2*

1桂林医学院生物技术学院 广西 桂林 541199

2桂林医学院附属第二医院 广西 桂林 541199

摘 要：柯萨奇A组4型（CV-A4）是肠道病毒A组成员之一，于1948年首次被分离鉴定，其感染人类可引起手足口病、弛缓性麻痹、疱疹性咽峡炎等疾病。近年来，CV-A4的感染率和发病率逐年上升，并已在世界范围内爆发多次流行，引起了人们的广泛关注。然而，CV-A4的致病机制仍不明确，目前也尚未研制出相应的疫苗及特异抗病毒药物。本文就CV-A4的基因组特征、致病性、分子流行病学、动物模型等方面的研究进展作一综述。

关键词：柯萨奇A组4型；分子生物学特征；流行病学；动物模型

柯萨奇病毒A组4型（Coxsackievirus, CV-A4）属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus，EV），是肠道病毒A组的重要成员^[1]。CV-A4于1948年首次被分离鉴定，此后在世界各地相继出现关于CV-A4的报道^[2]。CV-A4感染人类可以引起多种疾病，如手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)、急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis, AFP)、疱疹性咽峡炎（Herpangina，HA）、脑膜炎、心肌炎、急性出血性结膜炎、类感冒病症等^[3]。虽然与同组的HFMD主要病原体肠道病毒71型（Enterovirus A71，EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CA16）相比，CV-A4的分离率较低，以散发病例为主，但随着HFMD病原谱的不断发生变化，近年来非EV-A71和非CV-A16的构成比有所增加，其中CV-A4的感染率和发病率逐年上升，成为引起HFMD的主要病原体之一^[4]，引起人们的广泛关注。本文就CV-A4的基因组特征、致病性、分子流行病学、动物模型等方面的研究进展作一综述。

1. CV-A4基因组特征

CV-A4为单股正链RNA病毒，其基因组全长约为7400个核苷酸，包含一个开放阅读框（Open reading frame，ORF），大约编码2200个氨基酸，是一无包膜的二十面体立体对称结构颗粒^[5]。所有的EV的基因组结构相似，主要由四个部分组成，按病毒完整基因组顺序排列依次为5′端非编码区（5′untranslate region，5′-UTR）、编码多聚蛋白的ORF、3′端非编码区（3′untranslate region，3′-UTR）及与3′末端相连的多聚腺苷酸尾（ploy-A）。ORF编码的多聚蛋白可被病毒自身编码的蛋白酶水解分裂成3个蛋白前体（P1、P2、P3）。P1蛋白进一步水解可分成4个病毒衣壳蛋白（VP1~4），其中VP1、VP2、VP3均暴露在病毒颗粒表面，是抗原决定位点以及决定病毒组织嗜性的受体识别位点主要存在位置，可介导病毒与细胞表面特异性结合、吸附并进入靶细胞；P2和P3进一步水解成7个非结构蛋白（2A~2C和3A~3D），这些蛋白与病毒基因组复制以及病毒颗粒包装有关，涉及RNA复制、蛋白质加工和终止宿主细胞翻译等功能^[6]。

2. CV-A4致病性

流行病学资料分析显示，CV-A4感染人类引起发病主要集中在4到7月，患者性别男多于女，发病年龄多集中于5岁以下儿童的特点，与肠道病毒总体感染特征相一致^[7]。CV-A4与多种临床表现有关，从轻度呼吸道和胃肠道感染到严重的中枢神经系统感染，如类感冒、HFMD、AFP、HA等。现研究已证明CV-A4为重要的HFMD病原^[8]。HFMD是一种由多种肠道病毒引起的常见传染病，主要发生于儿童，以手、足、口等部位出现散发性皮疹和疱疹为表现特征, 多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起严重的并发症，个别重症可导致死亡^[9]。CV-A4与HA的发病密切相关^[10]。HA表现为持续时间较短但体温较高的发热以及喉咙痛和咽部出现水泡或溃疡。个别CV-A4感染还可导致严重的AFP^[11]、心肌炎和胰腺炎^[12]。最近，有病例报道发现CV-A4还与严重的急性横纹肌溶解、急性心包炎^[13]和双侧多发性阻塞性视网膜血管炎^[14]发病相关。目前CV-A4的致病机理尚未清楚，还需深入研究。

3. CV-A4分子流行病学

   1. CV-A4流行地区

1948年，CV-A4原型株HighPoint在美国北卡罗来纳州的一个脊髓灰质炎流行社区的污水中首次被分离鉴定^[2]，此后世界范围广泛传播。CV-A4在地理上分布广泛，流行于世界各地，尤其是泛太平洋地区。在我国CV-A4的首次分离可追溯至1996年，由山东省的AFP监测系统监测发现，此后陆续在吉林、四川、云南、广东、台湾等省份地区被分离鉴定

^[15]。可见，CV-A4在我国的传播具有流行时间较长、地域分布较广的特点。随着HFMD病原谱的不断变化，CV-A4在我国多个地区的非EV71和非CV-A16病原中居于前列，并引起了多次流行。报道显示，2004年和2006年在我国台湾地区先后暴发了两次由CV-A4引起HFMD疫情^[2]，2011年和2018年在北京市暴发2起CV-A4为病原的聚集性发热^{[16, 17]}，2012年和2014年在深圳市引起2起CV-A4导致的HA疫情^[10]，威胁公众健康安全。

1. 2. CV-A4分子分型分析

自1999年Oberste^[18]等建立了根据VP1序列分析进行EV分子分型的方法，此后该方法被不断推广应用，现已成为了划分EV基因型的主要手段。Chen等^[15]研究近年来CV-A4在我国及周边国家的传播流行情况时，使用18个国家的218条CV-A4完整和部分VP1序列构建系统发育进化树，发现CV-A4可被分成两个不同的谱系，即谱系1和谱系2，各谱系之间VP1部分核苷酸具有至少14%的差异。CV-A4分布具有时间和区域聚集的特征，其中谱系1聚集了96.8%的CV-A4毒株，范围涵盖1996-2016年时期的亚欧16个国家，为目前CV-A4的主流谱系。谱系1由A-D共4组构成，我国的141株CV-A4在4个组中均有分布，其中95%的毒株聚集在A组，形成了一个我国主要的系统发育类群。相比于表现活跃的谱系1，谱系2中的CV-A4的分离时间相对久远，分布也相对简单，仅聚集了包括原型株在内的共7株CV-A4，除了分离于美国的原型株，其余6株分布在非洲和欧洲，特别是肯尼亚、尼日利亚和荷兰。

郭悦^[19]报道的CV-A4分型规则与Chen等相似，基于VP1全长序列以15％以上的核苷酸差异为分型原则将世界范围的58条CV-A4划分为A、B、C、D四个基因型，进而以核苷酸差异大于8％为原则C基因型被划分为五个基因亚型C1-C5。其中A、B、D三个基因型分别由1948年美国分离的原型株、1999年一株肯尼亚的CV-A4分离株（GQ176232.1）以及2008年日本的CV-A4分离株（AB457644.1）单独形成。C基因型的毒株组成丰富，为目前世界范围主流的基因型，与Chen等研究的CV-A4谱系1相似。C基因型被分为5个基因亚型，我国CV-A4分离株主要处于C2亚型，且该亚型仅由我国分离株组成，包括了2006-2016年期间分离于19个省（自治区、直辖市）的36株CV-A4。可见C2基因亚型是我国CV-A4的绝对优势基因亚型，并在全国地区范围持续循环流行。

1. 3. CV-A4分子进化钟分析

分子进化钟是一种通过分子的变化来推断病原进化时间的分析工具。Chen等^[15]用分子钟分析估计CV-A4的平均进化速率为6.4×10⁻³个替换位点/年，起源时间推测在1944年左右，与Chu等^[20]研究相似。系统地理分析表明CV-A4的起源可能在美国，但区域传播主要分布在亚欧地区。研究推测我国CV-A4分离株的祖先出现在1978年，大概为潜伏在日本的CV-A4病毒株输入。CV-A4在1989年经山东省传播到了大陆地区（山东，四川和广东），随后在国内进一步产生了更复杂的途径，在各省之间发生更频繁的活动。CV-A4的时空动态表现为病毒在地区间的频繁传播，而来自山东省的病毒似乎在中国及其周边国家的传播中起着中心作用^[15]。

1. 4. CV-A4的基因重组情况

基因重组是EV进化的重要机制，很多研究已表明CV-A4在非结构蛋白区存在广泛重组现象。其中CV-A4与EV-A71的重组较为频繁。张宝敏^[8]对我国CV-A4毒株与EV-A组毒株进行重组分析，发现2009年广东省的1株EV-A71在3D区极有可能与CV-A4发生重组。Yang等^[21]报道2014年重庆市的一例HFMD病例标本分离而得的EV-A71 B5基因亚型毒株与CV-A4在P2区发生重组。Zhang等^[22]在研究我国大陆流行的EV-A71 C4基因亚型毒株与CV-A4的原型株在P3区也发生了重组现象。CV-A4与同组CV-A2、CV-A5和CV-A6的重组事件也有报道。Hu等^[6]报道了2009年深圳市的1株CV-A4与CV-A2在P2和P3区发生重组。Feng等^[23]在研究2012年上海爆发的一起由CV-A6引起的HFMD疫情时，发现CV-A6与CV-A4在2C区发生重组，并且这种重组后CV-A6使患儿出现更严重的全身性皮疹。同时，郭悦^[19]的研究发现我国CV-A4的C2基因亚型毒株在P3区和5′-UTR区分别与CV-A5和CV-A6发生了重组，且与CV-A5发生重组的CV-A4毒株均分离自重症HFMD病例，提示P3区的基因重组事件对CVA-4 C2基因亚型的流行和毒力增强具有重要意义。

4. CV-A4动物模型

动物模型的成功构建对疫苗和抗病毒药物筛选评估至关重要。Zhang等^[24]通过CV-A4 YT226R病毒株，以肌肉注射的方式用104 TCID50 /小鼠的攻毒量对3日龄的ICR新生小鼠进行攻毒，成功构建了CV-A4感染新生小鼠模型。该CV-A4感染小鼠模型的临床症状表现包括垂死状态，共济失调，神经和后肢单发或双发麻痹，甚至死亡。免疫组织化学实验结果显示，以该方式攻击可成功在新生小鼠的后肢肌肉、脊柱肌肉和大脑中检测到CV-A4的病毒抗原，但在肠道中却没有发现，这可能与感染途径有关。感染小鼠的病理组织切片和qRT-PCR检测的器官CV-A4含量结果均表明CV-A4对肌肉组织具有明显的向性，且病毒在后肢肌肉组织中的快速复制可引起严重的肌肉纤维坏死、肌肉束破裂和后肢瘫痪。另外，促炎症细胞因子水平观察发现，致死性剂量CV-A4给予新生儿小鼠后 IL-6和IFN-γ的表达水平异常高，而IL-4表达水平明显低于对照组，推测CV-A4诱导的IL-6高水平和IFN-γ/IL-4比例失衡可能与严重的病理损伤有关。

5 小结

尽管CV-A4的检出率较低，但也曾在我国多次爆发引起疫情，威胁公共卫生和健康安全。目前国内外对CV-A4的研究相对较少，主要集中在分子流行病学。分子流行病学研究提示CV-A4毒株在我国流行传播已久，并以一定的速度遗传进化在全国地区范围持续循环流行。由于没有特异的药物及相应的疫苗，CV-A4随着人口不断地交换和迁移将在世界范围内持续传播，其造成大规模爆发的潜能不能被忽视。分子流行病学的研究虽然可以揭示病原流行的基因亚型和变异情况，但是目前对于CV-A4的发病机制、感染的影响因素、与宿主免疫的相互关系等多个方面尚未清楚，仍需要对CV-A4进行更加深入的研究。

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^#为共同第一作者，^*为通讯作者

1. 基金项目：广西高校大学生创新创业计划项目，柯萨奇病毒A组4型中和表位筛选鉴定(201910601040)。

2. 基金项目：广西高校大学生创新创业计划项目，柯萨奇病毒A4感染性克隆的构建与鉴定 (201810601002)

第一作者：黄思静 2000年4月 女 广西 本科在读 主要从事肠道病毒疫苗研发

通讯作者：何韵怡 1996年11月 女 广西 硕士研究生 主要从事肠道病毒疫苗研发