尼群地平毒性和致突变作用研究

尼群地平毒性和致突变作用研究

曹 莉

镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江 212000

摘要：目的探讨尼群地平毒性和致突变性,以评价其安全性.方法通过饲养液添加药物的给药途径，以不含测试化合物的饲养液为正常对照（也是系统对照），检测尼群地平及其三种杂质对斑马鱼胚胎发育的影响，包括致畸性和致死性的比较。结果：四种化合物的致畸作用依次为：杂质C ≥ 尼群地平 > 杂质B > 杂质A；致死作用依次为：杂质A＝杂质C >尼群地平 ≥ 杂质B。结论：尼群地

平有一定的毒性和致突变性.

关键词：尼群地平；毒性；致突变

利用斑马鱼模式动物，检测尼群地平及其三种杂质对斑马鱼胚胎发育的毒性（致畸性和致死性），并进行比较分析。

1、实验设计

通过饲养液添加药物的给药途径，以不含测试化合物的饲养液为正常对照（也是系统对照），检测尼群地平及其三种杂质对斑马鱼胚胎发育的影响，包括致畸性和致死性的比较。每种化合物测试三到四个浓度，每种浓度至少重复三次。胚胎在标准条件下发育；实验观察连续5天，必要时拍摄胚胎发育情况^[1]。统计数据为胚胎发育第3天（胚胎发育过程结束，3-dpf）的畸形和死亡数。

2、材料与方法

2.1样品及溶液配制

尼群地平、尼群地平杂质A （淡黄色）、尼群地平杂质B（淡黄色）和尼群地平杂质C（白色）等四种化合物样品均由中检所化药室提供，均避光保存。

母液均用DMSO配制。

测试液配制：用人工海水稀释母液，各种浓度各配7～10 ml。pH：6-8。

尼群地平测试液浓度： 0.001、0.01、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 g/ml；

尼群地平杂质A测试液浓度： 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/ml；

尼群地平杂质B测试液浓度： 0.1、1.0、10.0、15、20、25 g/ml；

尼群地平杂质C测试液浓度： 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/ml。

2.2实验动物

斑马鱼AB line和TU line (Zebrafish, Danio rerio )

2.3实验程序

取50 % 外包期胚胎（每组30枚）浸入约2 ml测试药液中，考察胚胎发育的变化，为测试组；以在1％DMSO海水中发育的胚胎为系统对照组；标准环境下孵育，持续3天以上。每天观察记录（必要时拍摄）胚胎发育情况^[2]，如脑、眼、心、血流、躯干（脊索/神经管、体节）、胚体生长速度、游动及对刺激的反应能力等（包括统计发育第3天的畸形和死亡数/存活胚数），直至实验结束。每种浓度的测试液实验平行三次。数据处理：致死率以三次实验的平均值加标准差来表示。

3实验结果

斑马鱼胚胎发育全过程从受精卵分裂开始到胚胎发育完成（孵化）共需3天时间，因此为了充分了解尼群地平及其杂质化合物的胚胎发育毒性^[3]，我们将原肠期（三胚层形成并开始分化）胚胎暴露于待测化合物中直至孵化期（受精后72小时），以1％DMSO海水处理的发育胚胎为系统对照组，以未经处理的胚胎为正常对照，考察了胚胎发育全过程的变化。共进行了四种化合物、每种化合物至少5种浓度（共23种，见“测试液配制”）的胚胎致畸实验。

3.1 畸形率和死亡率的比较

在致畸性方面，如图6-42所示，当浓度为1.0 g/ml时，尼群地平和杂质C的致畸率均达100％左右，而杂质A 和杂质B则分别为4.4％和21％，故这四种化合物的致畸性依次为：杂质C ≥尼群地平>杂质B >杂质A。此外，数据显示尼群地平和杂质B的致畸作用的浓度范围(分别在约0.1～20 g/ml和1～25 g/ml)比杂质A和杂质C要广(分别在约1～5 g/ml和0.1～5 g/ml之间)。

在致死性方面，如图1所示，当浓度均为10 g/ml时，杂质A和杂质C的死亡率均达到100％，且杂质C在2 dpf内全部死亡；而尼群地平和杂质B的死亡率则分别为9％和4.4％，且二者直至20 g/ml或25g/ml l浓度处理时，仍未见胚胎明显死亡，其致死性明显低于前二者。故这四种化合物的致死性依次为：杂质A＝杂质C >尼群地平≥杂质B。

图1. 尼群地平及其三种杂质的致畸性和致死性比较

图中数据为胚胎发育第三天的畸形率和死亡率。

3.2 致畸表型的分析

尼群地平和三种杂质对胚胎发育的致畸表型相似，且具有浓度依赖性^[4]。他们共同的畸形表型主要有：胚胎体长变短而弯曲、体轴结构不清晰－分化差、紊乱，胚体透明度变差，脑区和眼睛变小，心脏成索状且无血色（无血液），心律弱而缓，围心囊肿大，总主静脉淤血及与其相邻的卵黄囊区域内陷等畸形。孵化期，幼体自主性游动和对触动反应均由弱到消失。根据这四种化合物导致胚胎畸形表型的严重程度——剂效关系分析，当浓度为1 g/ml时其致畸性依次为：杂质C ≥尼群地平>杂质B >杂质A；当浓度为10 g/ml时依次为：杂质C >尼群地平=杂A >杂质B。由于在高浓度作用下，畸形表型达到极限而无法分辨，故在本实验中以1 g/ml浓度处理的结果进行综合评估。

4结论：

1. 通过致畸率、致死率和畸形表型的比较，发现尼群地平及其三种杂质对斑马鱼胚胎致畸表型很相似，推测其作用机理可能相同。其畸形表型提示，这些化合物主要干扰了斑马鱼胚胎的神经系统、骨骼和肌组织、心血管系统的发育，以及内脏的形成。

2. 四种化合物的致畸作用依次为：杂质C ≥ 尼群地平 > 杂质B > 杂质A。

3. 四种化合物的致死作用依次为：杂质A＝杂质C >尼群地平 ≥ 杂质B。

4. 估测四种化合物的致畸浓度范围：

尼群地平：0.1～20 g/ml

比杂质A：1～5 g/ml

杂质B：1～25 g/ml

杂质C：0.1～5 g/ml

参考文献

[1] 宋述辉, 周静, 刘以农,等. 鹿茸酒的毒性与致突变试验研究[J]. 卫生研究, 1995(S2):69-74.

[2]赵泽贞, 魏丽珍. 5种可食性天然植物的抗突变及致突变实验研究[C]// 2000全国肿瘤学术大会. 

[3]陈丽娟, 唐希灿, 王美瑛,等. 刺乌头碱的毒性和致畸作用研究[J]. 实验动物与比较医学, 1989(1):5-7.

[4]陈汝家, 周盛梅, 朱俊靖,等. 斑马鱼模型在药物毒性与安全性评价中的应用[C]// 全国有毒中药的研究及其合理应用交流研讨会. 2012.