犬椎体置入骨水泥PMMA联合放疗后局部椎体和脊髓组织的病理学改变

犬椎体置入骨水泥 PMMA联合放疗后局部椎体和脊髓组织的病理学改变

顾祖超 王崇文

成都市第一人民医院骨科 四川成都 610041

【摘要】　目的　研究犬椎体内置入骨水泥PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）联合放疗后，局部椎体和脊髓组织的分布剂量和病理学改变。方法　实验动物分组：将16只比格犬分为2组: 空白对照组8只、 PMMA组8只。每只比格犬于术后对胸10椎体实施精确放疗，总剂量为50Gy。放疗后一个月处死试验犬，取椎体和脊髓，进行组织学的光镜和电镜观察，应用TUNEL法检测脊髓神经细胞的凋亡程度。结果　HE染色观察到对照组骨陷窝内骨细胞大部分坏死，偶见正常细胞，空骨陷窝增多。PMMA组骨陷窝内骨细胞部分坏死，骨小梁纹理排列紊乱。透射电镜提示对照组可见大部分细胞完全崩解，细胞膜形态消失，细胞核及细胞器完全崩消失。PMMA组见细胞质疏松，线粒体肿胀，粗面内质网扩张。TUNEL结果显示对照组可见很多凋亡神经细胞，主要集中于脊髓灰质前角及白质。 PMMA组犬脊髓可见少量凋亡神经细胞。结论 犬椎体植入骨水泥PMMA后，对局部的射线形成了一定的遮挡和散射效应，椎体骨组织和脊髓组织的损伤较轻。

关键词：骨水泥PMMA；犬椎体；局部椎体；分布剂量；病理学改变

前言

椎体成形术联合放射治疗已经成为治疗脊柱转移瘤的重要手段^[1]。放疗对肿瘤组织的杀伤、抑制疼痛介质的释放作用加上椎体成形术的固定骨折、放热反应、脱水作用和缺血坏死等效应更加有效地治疗了肿瘤溶骨破坏，同时弥补了相互之间的不足^[2]。因此，椎体成形联合放射治疗是临床上治疗脊柱转移瘤的优选方法。本研究在前期工作基础上，研究体内植入骨水泥PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）对犬椎体放射治疗后组织的分布剂量和吸收剂量的影响，观察椎体和脊髓组织的病理学改变，为临床治疗提供实验参考依据。

材料和方法

一、实验动物模型制作及分组

 这项研究通过成都市第一人民医院伦理委员会审批。本研究选用的比格犬，购于四川省医学科学院实验动物研究中心。将16只比格犬分为2组: 空白对照组8只、 PMMA组8只。将PMMA含(10%Baso4)制成5 mm×5 mm×5 mm大小骨水泥块备用。在CT透视机下定位胸10椎体，将PMMA骨水泥块植入椎体。空白对照组行手术取骨，并将骨块原位回植。

二、实验动物实施放射治疗的方法和步骤

 (1) 制作热缩体膜：将体膜固定板置于体膜制作床上，使固定板侧缘与床边平行。头颈部使其处于正常位置避免过伸，俯卧于固定板上，通过矢状线与比格犬鼻尖、脊柱、后臀沟中位重合，固定板两侧刻度的卡槽读数相同；（2）放射靶区的确定及CT准确扫描定位：本研究经过前期研究提示，犬胸10椎体较大，接近于人，实验结果容易观察，故将其定制为放疗靶区。将比格犬麻醉后，置于放疗仪体膜内，采用飞利浦Mx8000多层螺旋CT扫描机进行扫描。将胸7-腰1椎体采用飞利浦Mx8000多层螺旋CT扫描进行2mm层厚密扫；（3）放射椎体及脊髓组织的勾画，CT三维重建：将采集到的CT扫描图像数据通过Varis局域网传送至Somavison系统内，将CT扫描后的影像传导到放疗系统的三维计划系统上，并进行靶区影响的重建，放射靶区的勾画，重要器官的勾画。将比格犬脊柱CT影像进行的分析，最终确定胸7-胸12椎体及附件区域为放射靶区，对其进行勾画后，对脊髓组织进行勾画；（4）放疗计划的制定实施：再次确定、分析制定完毕的脊柱图像引导放疗方案，专业放疗及时采用ECLIPSE逆向治疗计划系统制定脊柱图像引导放疗方案；（5）处方剂量：每只比格犬于术后一月实施精确放疗，每日剂量为5Gy，每周五次，两周完成，总剂量为50Gy。

三、标本采集与处理

放疗结束后一个月,处死试验犬，取胸10椎体及相应的脊髓，进行组织学和电镜的显微结构观察，应用TUNEL法检测脊髓神经细胞的凋亡程度。

四、观察指标

（1）HE染色:制备5μm石蜡切片，经脱蜡、水化、苏木素染核、盐酸酒精分化、伊红染浆、脱水透明，最后中性树胶封片，光镜下观察骨组织形态。

（2）骨组织透射电镜步骤：医用戊二醛溶液对留取的标本进行浸泡，然后对组织块再次进行浸泡，缓冲液漂净、冲洗。采用阶梯浓度的酒精对组织块进行浸泡，后缓冲液漂净、冲洗。固化剂、环氧树脂、苯甲酸二丁醋侵泡、在组织包埋完毕后烤干，硬化后包埋成块。将包埋成块的组织修成塔形，并将其修薄片，铺于金属铜网表面。采用拘椽酸铅以及醋酸铀对铺于金属铜网表面的组织薄片进行染色。透射电镜进行采图、观测并留取相片。

（3）TUNEL实验结果判读: TUNEL染色时，阳性细胞会呈现棕褐色，阳性细胞越多，代表损伤越严重，反之，阳性细胞越少，损伤越小。阴性对照以试剂盒中的标记溶液代替TUNEL反应混合液，标记步骤同上。应用MPIAS彩色病理图像分析系统，每张切片选10个凋亡细胞最密集的视野，计算脊髓神经元凋亡指数。

（4）统计学方法:采用SPSS 19.0统计软件包进行分析。实验数据以均数士标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和脸验，P值<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、HE染色

HE染色观察光镜下可观察到对照组骨陷窝内骨细胞大部分坏死，偶见正常细胞，空骨陷窝增多，松质骨内骨小梁结构破坏严重，骨小梁部分断裂，骨髓腔内骨髓细胞少见，松散地填充于骨小梁之间（图1 A）。PMMA组骨陷窝内骨细胞部分坏死，骨小梁纹理排列紊乱，纹理不清，骨小梁之间造血细胞数量变少（图1 B）。

二、透射电镜

透射电镜结果提示对照组除可见损伤严重的细胞外，还可见部分细胞完全崩解，细胞膜形态消失，细胞核及细胞器完全消失，只剩下少量细胞碎裂、残余物质（图2 A）。PMMA组骨细胞见胞质疏松，线粒体肿胀，甚至空化，粗面内质网扩张，脱颗粒，间隙增大，细胞核崩解、消失，染色质固缩并凝结成块聚集于核膜（图2 B）。

三、TUNEL实验结果

TUNEL实验结果显示对照组脊髓神经元中可见很多凋亡神经细胞，主要集中于脊髓灰质前角及白质。PMMA组髓神经元中可见少量凋亡神经细胞，主要集中于脊髓灰质前角和白质。

表 1 两组脊髓组织的凋亡表达(x±s）

注：a：与PMMA组比较， P＜0.05。AI：凋亡指数。PMMA组与对照组 AI的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

讨论

椎体成形术联合放射治疗脊柱转移瘤，既利用了椎体成形治疗直接、起效快速且疗效持久的特点，又可以发挥放射治疗对单一病灶疗效显著的优点，有效弥补了单纯放射治疗的缺陷。研究结果表明^[3]，单纯放射治疗方法和椎体成形辅以放射治疗都能明显缓解患者的骨痛程度，但后者较前者的缓解程度更为显著。另外，从治疗的起效时间上看，椎体成形联合放射治疗的方法早于单纯的放射治疗方法，且最终的有效治疗病例更多。两种单独治疗方法在机制上有明显的互补作用，放疗对肿瘤组织的杀伤、抑制疼痛介质的释放作用加上椎体成形术的固定骨折、放热反应、脱水作用和缺血坏死等效应更加有效地治疗了肿瘤溶骨破坏，同时弥补了相互之间的不足。

国内的研究表明，对犬椎体实施60 Gy的放疗，透射电镜观察显示放疗组的脊髓血管形态,内皮细胞超微结构均有明显的病理改变，其结论认为放疗可影响脊髓血管形态及血流量,这可能是放疗所致脊髓功能障碍的重要因素之一^[4].另外一项研究表明对犬椎体实施50-80Gy的放疗总剂量，实验犬在放疗开始后4周时T2WI影像图像上所示椎体信号为不均匀增高，在开始后6周时T2WI影像图像上大部分椎体进展为成为均匀的高信号^[5]。本研究的放疗总剂量为50 Gy, 但在PMMA组的损伤程度明显小于空白对照组，表现在椎体的骨陷窝内骨细胞仅有少部分坏死，骨小梁纹理排列紊乱，纹理不清。而透射电镜结果提示，PMMA组骨细胞的胞质疏松，线粒体肿胀。由于骨水泥的存在，其密度远大于人体的各种组织密度，高能X射线或γ射线在照射时一方面可以通过反射作用，其椎体的病理学结果提示了射线在骨水泥的周围形成了部分的遮挡效应和散射效应。

本研究在放疗结束后一个月处死实验犬，显示PMMA组脊髓神经元中可见少量凋亡神经细胞，主要集中于脊髓灰质前角和白质。而另外的一项研究表明^[6]犬椎体照射3个月后脊髓中存在着明显的放疗迟发反应，通过放疗后脊髓神经元形态学,神经元凋亡指数,凋亡蛋白Caspase-3表达等指标的测定结果提示脊柱IMRT的脊髓安全性远优于普通放疗。上述研究结果提示在放疗方案和剂量、放射野、等角度和不等角度、放疗后不同组织的反应程度等因素的交互影响下，放射方案的不同，脊髓神经元细胞的损伤也不尽相同。PMMA骨水泥对活体椎体肿瘤细胞存在抗肿瘤作用，而在动物实验的结果表明犬椎体植入骨水泥PMMA后，对局部的射线形成了一定的遮挡和散射效应，椎体骨组织和脊髓组织的损伤较轻。这项研究为今后的临床治疗提供了相关的实验参考依据。

参考文献

[1] Lei M , Liu Y , Liu S , et al. Inpidual strategy for lung cancer patients with metastatic spinal cord compression[J]. European Journal of Surgical Oncology (EJSO), 2016, 42(5):728-34.

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[3] 孙建业, 伦俊杰, 胡效坤,等. 椎体成形术联合调强放射治疗脊柱转移瘤疗效[J]. 中国介入影像与治疗学, 2019, 16(11):676-679.

[4] 徐万龙，白靖平，锡林宝勒日,等. 犬脊柱放疗对脊髓血管形态及血流量的影响[J].重庆医学，2010, 39(23):3168-3169.

[5] [1]沈永刚, 徐万龙, 杨辉,等. 脊柱图像引导放射治疗方案优化的实验研究[J]. 中国脊柱脊髓杂志, 2013, 23(9):827-832.

[6] 锡林宝勒日，徐万龙，陈刚,等. 脊柱IMRT和普通放疗脊髓生物安全性的比较[J].中华放射医学与防护杂志，2010, 30(1):15-19.

成都市医学科研课题 （2019002）

通讯作者：王崇文 成都市高新区万象北路 18号

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