微流控芯片的研制与应用研究

微流控芯片的研制与应用研究

唐勇

成都微康生物科技有限公司 四川 成都610000

摘要：微流控芯片又被称作为生物芯片或芯片实验室，这一技术的发展与应用为微生物研究、基因工程研究、临床化学诊断等工作带来颠覆性突破，为早期诊断和预防心脑血管疾病、癌症等病症提供技术支持。本文基于微流控芯片应用价值和研究现状，探究微流控芯片的制作方法，并思考在心脑血管检测方面的应用。

关键词：微流控芯片；心脑血管疾病检测；临床诊断

引言

在临床化学诊断、微生物研究、免疫研究、基因研究等方面应用微流控芯片技术，能够在早期诊断和预防心脑血管疾病、癌症等影响人类身体健康的病症中发挥积极作用[1]。综合生物靶向药物和生物芯片，加快推进临床医学全面朝向个性化医学诊疗方向发展。

一、微流控芯片技术分析

伴随着微分析技术需求不断提高、微流控芯片技术研究工作日渐开展，设计完成的构型日益丰富，所以当前 市面上出现很多类型多样、形态各异的微通道网络结构芯片构型。就电泳芯片分离通道而言，其有折叠型、多边形、弯曲蛇形、螺旋形以及直线形多种形式的网络结构[2]。微流控芯片技术由于受到生化分析杜阳性需求和复杂性需求的影响，其发展逐渐倾向于集成化和组合化，为提升芯片的性能，使其功能趋向于多元化，需要集成过滤装置、生物反应器、化学反应器等多个单元，顺利分析与检测多种样品，在筛选药物、检测细胞、蛋白质、氨基酸、突变点和DNA中，均具有积极作用[3]。

根据高通量快速分离的基本需求做出分析，在微流控芯片设计与研发中，多通道阵列并行操作是未来的主流趋势。当前，芯片通道数量已经取得显著发展成果，从最开始的12通道和96通道，逐渐发展到384通道。

二、微流控芯片制备

（一）光刻和刻蚀技术

在集成电路芯片和半导体制作期间采用的传统光刻和刻蚀技术，是在微流控芯片技术领域最为基础的工艺手段，该技术综合紫外光、掩膜、光胶等实现微细加工，时至今日，已经形成了相对比较成熟的工艺，并且在石英基片、玻璃以及硅上制作微结构具备广泛的应用。薄膜沉淀、光刻以及刻蚀是组成光刻和刻蚀技术的关键工序，倘若是微结构相对比较复杂，那么可对薄膜沉淀、光刻和刻蚀三个工序循环重复操作[4]。

光刻时首先要在干净的金属基片上涂抹一层薄膜，通常薄膜的厚度为数埃至几十微米，这一工艺步骤就叫做覆膜沉淀。薄膜根据性质不同可分成器件作用区域的外展层，限制区域扩散的掩蔽膜，起着防护、钝化和绝缘等功能的绝缘材料层，以及用于阴极反应的通过导线与器件表面相连的导电金属层等。膜料一般有二氧化硅、氮化硅、硼磷硅玻璃、多晶硅、高输出电导金属、光刻防蚀胶、难降解金属等。生产加工抹子的主要途径是氧化、化学气相沉积、蒸馏、溅射、超声波喷涂沉积等。

在薄膜上均匀的涂抹了一层光胶，把掩膜的微流控设计图样利用曝光成像的方式传递到光胶层上的工艺，叫做光刻。

①基片的预处理

采用脱脂、抛光、酸洗、水洗等的加工技术将基片表面处理好，保证了光刻胶在基片外表上有良好的附着。

②涂胶

在经处理的金属基片上，均匀涂抹一层黏性较强、厚薄适宜的光刻胶。胶层若太薄，易生成针孔，且耐蚀性能也较弱;过厚时就无法完全显影了，并将减少清晰度。因此光刻胶的实际厚薄主要和它的黏度成相关关系，并和甩胶电机的运转速率的平方根成反比关系。涂胶方式主要有旋转髹漆法、刷漆法、浸渍法、喷涂法等。

③前烘

在特定的环境温度下，使光刻胶液中的有机溶剂迅速挥发，提高了光刻胶对与基片粘附的橡胶层的耐磨程度。前烘的温度控制和持续时间根据光致抗蚀剂的类型和厚度确定，常选用电热恒温箱、热气流或红外电阻加热。

④曝光

把已设计好所需要芯片形状的光刻掩膜盖在基片上，再利用紫外光等通过掩膜对光刻胶进行选择性辐照。被外光辐照的光刻胶进行化学反应。在实践活动中，曝光深度根据光学刻膜、胶层厚度、灯光高度和灯光与基片距离确定。曝光的主要方法包括化学曝光、接触式和接近型复印曝光、或者光学投影图像曝光。

⑤显影

以光胶片配合荧光液，采用化学方式去除已经曝出的光胶(正光胶)或尚未曝出的光胶(负光胶)，因此荧光液和荧光时间的选取对荧光效率的负面影响较大。选用荧光液的主要准则是，对必须去除的那部分胶层溶解性大、溶解速率快，而对必须留下的那部分溶解性小。而显影持续时间视光致抗蚀剂的类型、胶层厚薄、荧光液类型、显影剂温度，以及操作方式等而异。

⑥坚膜

将显影后的基片进行洗涤后在一定高温下烘焙，以完全去除显影后残存在胶层中的溶剂及水分，使胶层和基片牢固附着，避免胶合层剥落，从而提高胶层自身的耐腐蚀能。建膜的气温和时间都要适宜。

（二）热压法

热压工艺（hot embossing）是一个使用较多的高速复制电泳微通路的电子芯片制造工艺，主要应用在PMMA和PC等热塑性高分子材料上。热压法的模具材料一般为孔径在50 μm以内的金属导线，或者刻蚀有凸突的金属材料微通道骨片阳膜，如钴基阳模、单晶硅电池阳模、玻璃阳模、经微机械加工后的金属材料阳模

[5]。此法可大规模制作，加工技术简易，操作简单，但使用条件限制。

（三）模塑法

用光刻和刻蚀的方式，首先制造出阳模（所需通道部分凸出），再浇注液态的大分子物质，接着把凝固后的大分子物质和阳模剥离，从而获得了具备微通道芯片结构的这样制造微型晶片的方式，叫做模塑法。模塑法的关键在于模具材料和高分子化合物材质的选用，理想的材质应相互之间粘附能力小，便于脱模[6]。

微通道的阳膜可通过硅塑料、玻璃、环氧基SU-8负光胶和PDMS等材料制备。硅及玻璃阳膜也可使用标准刻蚀方法。PDMS模型也可采用直接水泥浇注，在用硅材料、玻璃等原料制的母模上加工制成。

浇注用的高分子复合材料必须具有较低粘点，以降低凝固温度。在高压力情况下，可产生模子表面的微通道和凹陷之处。目前可用的材料主要有两种:固化型聚合物和溶剂性挥发型聚合物。

尽管模塑法局限于生产高分子塑料，但由于此方法的简便易行，晶片也可以大量复制，而且不要求很高昂的机器，是一种适合生产廉价高分析晶片的方法。

（四）注塑法

注塑法的主要工艺流程，是采用光刻和刻蚀等技术从硅晶圆上刻蚀出各种金属电泳芯片阴模，用此阴模经过24h的电成形，可以获得0.5cm厚度的金属镍合金模，而后再将镍合金模加厚，再仔细制作成各种金属材料的注射模型，将此模放置于各种金属材料注塑机上大规模制造的合成微流控芯片基片[7]。

在注塑法制造流程中，由于模具制造过程繁琐，对工艺技术要求高，生产周期较长，因此是整套流程中的重要环节。一种好的模型可以制造30~50万张聚合物芯片，复制性好，制造周期短，产品成本低，适合于已成形的芯片制造。

（五）LIGA技术

LIGA是德文Lithographie，Galvanoformung，Abformung三词的字头简称。LIGA工艺主要由光刻、电成型和塑铸三部分构成。

准LIGA工艺技术则是利用紫外线照射光源来代替LIGA工艺技术中的同步射线X光深层光刻，从而完成了后期的微电铸和微复制等工序。它并不要求同步辐射X光光刻技术和专用的X光掩膜板，而是可以进行微型机械元件的大批量生产。而按照紫外光深光刻的加工途径的差异，准LIGA工艺技术又可分成多层光刻-LIGA、硅模深刻蚀-LIGA和SU-8深光刻-LIGA三种。

（六）激光烧蚀法

激光烧蚀法是一项非接触式的微细结构加工技术。它可以直接通过电脑CAD的数据，在金属材料、塑胶、陶瓷等材质上加工复杂的细微结构，已广泛应用于微模和微型通道的加工。这种方式对技术设备的要求较高，但操作简单，且不要求超净环境，精度高。但也因为紫外激光辐射能量较大，具有相当的危害性，因此必须在规范激光试验室中开展作业，并采取了安全的防护装置和防护眼镜[8]。

（七）软光刻

软光刻技术（soft lithography）是指相比于在微观加工技术中占主导的光刻工艺生产技术来说的将微图形转移与微观机械加工的方法，以自装配单分子层、弹性印章以及高聚物模塑工艺技术为核心的微观机械加工方法。它主要用于生产繁杂的三维形状和不规则曲面；可广泛应用于生物大分子、固体、玻璃、陶瓷及各种物质；没有相关散射产生的精度影响，能够实现30nm~1μm量级的小测量；因此软光刻是一个廉价、简单，适合实验室应用的方法[9]。

软光刻技术的核心内容是弹性模印章，可采用光刻蚀和模塑的方式制成。PDMS是软光刻中，最常见的弹性模印章。软光刻的加工技术，一般包括微接触印刷、再铸型、微移动成模、毛细管成模、溶剂辅助成模等。

三、微流控芯片在心血管疾病检测中的应用

（一）实验准备

在组织实施实验检测之前，需要做好各类实验设备和实验试剂的准备工作。实验准备如下表所示：

表1 实验准备示意表

（二）实验过程与结果分析

将自主研发的实验产品和某上市公司研究投产的产品展开的对比分析，某上市POCT企业试剂盒的检测范围为100-20000 pg/mL，自主研究的试剂盒检测范围为：30-35000 pg/mL，分别对本司30-35000 pg/mL、100-20000  pg/mL检测范围进行方法学比对。以对比系统检测结果为X轴，试验系统检测结果为Y轴，作回归曲线，得到回归公式、相关系数r。在开展精密度检测期间，需要测定低值、中值、高值三个浓度，并实现对其质量的控制，每组重复测定10次，并计算每组的CV。

分别使用自主研发的实验产品产品和某上市 POCT 企业产品进行检测， 检测结果见表2。 分别在 30-35000 pg/mL和100-20000 pg/mL的检测范围内，以国外某企业检测值为X，自主研发产品实测值为Y，作回归曲线（图1和图2）。在100-20000 pg/mL的检测范围内，以国外某企业检测值为X，某上市POCT企业产品实测值为Y，作回归曲线（图3）。

表2 自主研发产品与某上市POCT企业产品对比检测结果

图 1国外某企业与自主研发产品NT-proBNP产品相关性（30-35000 pg/mL）

图 2国外某企业与自主研发产品NT-proBNP产品相关性（100-20000 pg/mL）

图 3 国外企业产品与国内某上市企业NT-proBNP产品相关性

取3个浓度的NT-proBNP质控品对检测卡进行检测，检测数量10次，结果如表3，变异系数均小于10%。

表3 NT-proBNP精密度检测

在此次研究中发现，我们自主开发的检测系统在检测NT-proBNP这个标志物的检测范围30-35000 pg/mL、100-20000 pg/mL内相关性分别为R2 = 0.9857、R2 = 0.9757，与国外主流企业的检测系统均有较好的相关性，与国内同类氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒相比更加符合临床要求，性能优秀。线性范围内NT-proBNP检测灵敏度满足检测要求，低值样本和高值样本检测结果均具有要好的区分度。

测试NT-proBNP高、中、低3个浓度的样本，每份样本测定10次，所得结果的变异系数（CV）不大于10%，证实NT-proBNP检测卡的精密度较好。

四、结语

在体外诊断期间应用POCT检测是具有很大优势的，由于其检测时间比较短暂，且使用相对比较方便，兼具良好的检测准确性，在确定病因、预防疾病、预后效果等方面具有良好的应用价值。再者，使用该技术手段可以有效的降低医疗成本、提高治疗的有效性，满足各类机构的临床治疗效果。

参考文献：

[1]杨宁,张素亮,王亚飞,袁寿其,毛罕平,张晓东.基于气载微流控芯片的作物病害孢子流式动态检测方法[J/OL].农业机械学报:1-9[2022-08-16].

[2]敬灵芝,范苏娜,姚响,张耀鹏.基于微流控芯片构建复合力学刺激细胞反应器[J].传感器与微系统,2022,41(08):6-10.

[3]余逸,陈子郁,于丽丽.微流控芯片技术在中药研究领域的应用进展研究[J].华南国防医学杂志,2022,36(07):584-587.

[4]李璐,冯鑫,范一强.微流控芯片生物相容性的研究进展[J].微纳电子技术,2022,59(07):625-635+709.

[5]刘宇,GIUSEPPINA SIMONE.基因检测微流控芯片的研究、应用与发展[J].传感器与微系统,2022,41(07):1-4+20.

[6]李亚冰. 基于图案化氧化锌纳米棒阵列的生物荧光检测微流控芯片研究[D].华东师范大学,2022.

[7]张博源. InDel族群推断微流控芯片检测体系研究[D].中国人民公安大学,2022.

[8]鲍中华. 磁性与尺寸双重控制的微流控芯片用于三种流感病毒的同时检测[D].武汉纺织大学,2022.

[9]陈锦耀. 基于微流控芯片的自动化多重检测实验平台的搭建与应用研究[D].武汉纺织大学,2022.