幽门螺杆菌检测技术进展与展望

幽门螺杆菌检测技术进展与展望

朱小林1 ,乔苗苗1 ,吴洪波3    ,张全2,通讯作者

深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） 广东深圳518057

1. 深圳市伯劳特生物制品有限公司广东深圳 518000

【摘要】1984年，澳大利亚学者Barry.Marshall与Robin Warren首次在胃病患者的样本中发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)，并成功将其分离培养。1997年幽门螺杆菌的全基因组序列被测序完成。幽门螺杆菌检测方法众多，但是在灵敏度、特异性和准确率方面仍有不足。精准的检测技术是预防和根治幽门螺杆菌的关键技术手段，临床上幽门螺杆菌的检测方法可以分为侵入性和非侵入性两类，包括：内窥镜检测、细菌分离培养、组织学检测、尿素呼气试验(Urea Breath Test, UBT)、粪便抗原检测、血清学检测和分子检测等。

【关键词】幽门螺杆菌、感染、检测

1984年，澳大利亚学者Barry.Marshall与Robin Warren首次在胃病患者的样本中发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)，并成功将其分离培养，初步揭示了该菌与胃炎存在联系[1]。1997年完成幽门螺杆菌全基因组测序，对该菌的研究进入了一个新的阶段[2]。从发现至今已有近40年的时间，尽管该菌仍有很多谜团尚未解开，但科学家对该菌的生活史和生理特征已有比较清晰的认知。《H.pylori胃炎(日本)京都全球共识》(2015) 将幽门螺杆菌引发的胃炎定义为感染性疾病，认为幽门螺杆菌感染与人类消化性胃炎、胃溃疡和胃癌等疾病的发生、发展和转移有着密切的联系[3]。

现已明确，幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，通常为螺杆状，微需氧，通常定植于胃黏膜，由于不同幽门螺杆菌毒力的差异，仅不到一半幽门螺杆菌会导致感染者致病[4]。幽门螺杆菌可能通过口-口、粪-口等途径传播，确切的传播途径尚未确认。在临床上，很多感染者表现为无症状带菌者，不经检测不易发现，进而未对其重视。1994年,世界卫生组织WHO将幽门螺杆菌列为Ⅰ类致癌物，临床上推荐根除疗法作为预防胃癌的主要策略[5]。目前，幽门螺杆菌的感染率在西方发达国家有所下降，但是在发展中国家和新兴经济体依然居高不下[6]。中国作为发展中人口大国，14亿人口基数十分庞大，且由于中式的传统家庭生活，一人感染极易引起家庭成员的交叉感染，这给幽门螺杆菌的预防带来不小的难度。

当前，尽管幽门螺杆菌检测方法众多，但是在灵敏度、特异性和准确率方面仍存在诸多不足，特别是随着抗生素和PPI的不规范使用所导致的耐药性增加，即使是延长给药时间，都无法改变根除率逐年下降的趋势[7]。临床上，幽门螺杆菌的检测方法可以分为侵入性和非侵入性检测两类。侵入性检测是借助胃镜对胃组织采样后对样本进行检测，准确性高但依从性差；非侵入性检测不需借助胃镜，主要利用受检者的体液和血液样本进行检测，依从性较高但容易受诸多因素干扰。本文将综述性的介绍现有技术在临床检测中的进展情况，以及各自优点和缺点。

1侵入性检测方法

内窥镜检测是确定胃部病变是否由幽门螺杆菌感染引起的常规技术，对于幽门螺杆菌的检测具有重要意义。纤维胃镜可以对胃病变区域进行镜下观测和取样，样品可进一步用于快速尿素酶试验、细菌分离培养、组织切片检测以及基因检测。普通的内窥镜检查可在可观测到患者各种胃部病变，包括结节状胃炎、胃粘膜萎缩、皱褶病变性增大、肠化生和结节、胃溃疡和胃部癌变等[8]。高分辨率放大内镜可以更直接观测到胃肠粘膜的表面微结构，结合靛蓝胭脂红染色，可以更直观和清晰识别粘膜萎缩和肠化生等特殊组织病理特征。随着内镜技术的日新月异的发展，特别是无痛内镜技术的广泛开展，既往内窥镜检测的局限性大大地缩小了，内镜检测在临床应用越来越广泛和普遍，下面将详细讨论基于内镜技术的幽门螺杆菌侵入性检测方法。

1.1快速尿素酶检测H.pylori可产生活性很强的尿素酶，尿素酶可以分解尿素产生NH3和CO2， H.pylori快速尿素酶试验就是利用这一原理检测胃镜取材胃黏膜上的H.pylori，如果活检组织中的存在H.pylori，那么H.pylori将分解试剂钟的尿素产氨，使尿素酶试剂中的酸碱指示剂酚红由黄变为红色；反之，如果胃黏膜上没有定植H.pylori，那么将不产生尿素酶，也无法让试剂中的酚红指示剂变色。因此，依据试剂是否变色可以辅助诊断幽门螺杆菌的感染。但是，并非只有幽门螺杆菌产生尿素酶，很多其他细菌也可以产生尿素酶，这些细菌可能随着食物进入胃腔，特别是当消化功能不良、胃炎、消化性溃疡等消化道疾病发生的时候，胃的动力以及胃酸和消化酶分泌不良将会导致食物中的细菌在胃腔停留，而这些食物带来的细菌很多会产生尿素酶，在这种情况下，快速尿素酶有可能出现假阳性。

目前，国内外有多种商品尿素酶试剂盒出售，也可自行配置液体尿素酶试剂。快速尿素酶试验的灵敏度介于60～90%，特异性介于40%～70%。由于快速尿素酶试验可在胃镜检查时快速进行，操作简便易行，因此比较适合于在基层单位开展。然而，标本的大小、反应时间、环境温度等均可影响尿素酶试验的结果。观察时间短，敏感性低，特异性高；观察时间长，敏感性高，特异性差。由于结果判断是通过肉眼完成的，故结果易产生误差。另外需要注意的是，在胃内有活动性出血时，可影响尿素酶试验的敏感性和特异性。近期应用抗生素、铋剂或质子泵抑制剂可暂时减少细菌的数量，导致假阴性结果。有研究表明，标本中要有10

4以上的细菌才能显示阳性，因此，此方法不宜单独作为H.pylori根除治疗后的结果评价。总之，幽门螺杆菌快速尿素酶试验仅用于幽门螺杆菌的快速粗筛，不建议作为确诊试验。

1.2 细菌分离培养 通过胃镜采集胃黏膜标本后进行幽门螺杆菌的分离培养，是最为经典可靠的幽门螺杆菌感染诊断手段，理论上，针对幽门螺杆菌感染诊断，细菌培养方法的特异性为100%。尽管有人担心分离培养的敏感性，但随着采样规范化以及多点采样的实施，目前分离培养的敏感性也可以保证不低于95%，因此，分离培养作为幽门螺杆菌感染诊断的金标准是毋庸置疑的。目前临床上医生普遍先对疑似感染者进行快速尿素酶测定，对于尿素酶阳性的受检者再进行活检取样，用细菌培养法进行确诊[9]。幽门螺杆菌属于微需氧菌，培养条件较为苛刻，需要专门的培养装置。所需要的气体环境为5%氧气、10%二氧化碳和85%的氮气，通过混合气压调节维持培养的气体环境。培养基通常采用哥伦比亚琼脂、布氏琼脂或者脑心浸液琼脂等，培养温度为37℃，培养72h～120h。样本的质量、保存时间以及储存环境和温度，特别是选择培养基的质量均会影响细菌的培养，影响检测准确性。此外，药物（如PPI和抗生素）等影响细菌分离培养的成功率，一般建议受试者在受检前一周避免服用质子泵和抗生素等药物。分离培养还可以获得菌株表型特征及其基因型信息，从而能够较全面地分析其病理特征，为临床治疗方案提供决策依据。

1.3 组织学检测 胃镜检测过程中，活检取样后进行胃黏膜组织的病理检测是对怀疑有胃组织病变的常规操作。同时，依据镜下特殊的胃组织黏膜形态改变也可以辅助诊断幽门螺杆菌感染。同时，对于胃黏膜组织经过包埋、固定、切片后进行不同的染色，如苏木精-伊红染色（HE）、吉姆萨R染色、W-S 银染色和免疫组化染色等也可以观察幽门螺杆菌是否存在。临床上常规HE染色可以判断幽门螺杆菌的感染与否，但若患者伴有慢性胃炎，应考虑免疫组化染色进行辅助染色，防止漏检的发生[10]。由于幽门螺杆菌在胃部的分布密度不均，为提高检测准确性，通常建议从包括胃窦和胃体在内的不少于两个部分进行活检采样。研究表明，与单独胃窦取样活体检测相比，多点取样检测，可以将幽门螺杆菌的检出率提高10%以上。组织学检测也受到胃活检的部位、数量、大小和染色方法、抗生素及质子泵抑制剂等影响。

1.4 胃黏膜组织的幽门螺杆菌特异性核酸检测主要包括核酸分子杂交和多聚酶链式反应(PCR)，核酸分子杂交技术具有较高的特异性和灵敏度。PCR技术应用特异性引物和Taq DNA聚合酶，使标本中的目的核酸片断在几小时内扩增109～1012倍，扩增后的DNA再通过凝胶电泳或分子杂交进行检测。与常规培养方法相比，PCR可以定量、缩短诊断时间和减低成本。针对幽门螺旋杆菌基因的PCR，即使是在质量较差的样品中，也能够检测到10个拷贝以上。另外，胃黏膜组织的幽门螺杆菌特异性核酸检测还可以用于幽门螺杆菌针对特定抗生素耐药性突变的检测。

2非侵入性方法

  非侵入性方法与侵入性相比更简便易行，患者无需接受胃镜操作，规避了胃镜操作的风险和副作用，通过采集其他标本进行幽门螺杆菌感染的诊断。比较有代表性的有13C和14C尿素酶呼气试验、粪便幽门螺杆菌特异性抗原或核酸检测、血清幽门螺杆菌特异性抗体检测等，非侵入性方法简便、快速、通量高，更适用于流行病学调查、健康体检等。同时，血清学抗体检测还可以评价幽门螺杆菌的毒力水平，从而对幽门螺杆菌感染实现更加精准的诊断。

2.1尿素呼气试验(Urea Breath Test, UBT)尿素呼气试验是临床上广泛使用的检测幽门螺杆菌的非侵入性经典检测方法。该方法的原理是受检者口服13C或者14C标记的尿素胶囊，如果胃部存在幽门螺杆菌的感染，则标记的尿素会被幽门螺杆菌分泌的高效尿素酶分解生产同位素标记的二氧化碳和氨，其中二氧化碳快速入血液并经过呼吸作用后排出体外，通过检测检测呼出的同位素标记的二氧化碳来判断受检者胃内是否有高活性的尿素酶，进而推论是否有幽门螺杆菌感染。李莉[11]研究显示, 13C-UBT 及14C-UBT灵敏度、特异性和准确性均可达到95%左右，两者对感染实验诊断的准确性无显著差异，均可以准确反应幽门螺杆菌的感染情况，14C虽价格相对低廉，但考虑到其具有放射性，不适用于儿童和孕妇检测，因此13C更适合在临床推广。时晨洪等[12]采用新型的固体闪炼技术14C-UBT检测了100例有消化道症状的疑似幽门螺杆菌感染者，并与液态体闪炼技术14C-UBT的检测结果进行比较，研究结果证明两种检测结果的阳性率一致，检测感染者为59例。PPI和抗生素均可以影响检测结果，患者如果有消化道内出血也可能会造成UBT的假阴性，因此在进行该项检测时均需予以考虑。

2.2类便Hp抗原及核酸检测幽门螺杆菌在胃内定植生存、完成分裂增殖和新陈代谢，因此死亡细菌的菌体成分可进入胃液，通过粪便排出，菌体及菌体碎片均作为抗原物质，可以被相应的特异性抗体所捕获，从而实现免疫学检测。临床上，粪便抗原检测常作为儿童感染的检测的“替代方案”。《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》明确指出：尿素呼气试验是评估干预治疗疗效的首选手段，对于该手段依从性较差的人群可选择粪便抗原作为辅助检测手段。联合尿素呼气试验和类便抗原检测用于根除疗法的干预和诊断可以提高根除率，但该法必须在幽门螺杆菌在胃内生产达到一定密度时方可检出，而PPI和抗生素等药物治疗均可能降低菌株密度

[13]。因而，在采用粪便抗原检测时，应该根据患者的身体情况，在检测前一段时间内暂停PPI和抗生素等药物的服用。由于粪便成分复杂，会严重影响用于Hp粪便抗原检测的敏感性，粪便Hp抗原检测的低敏感性一直为人诟病，因此，该检测方法要获得突破需要粪便Hp抗原纯化分离技术首先获得突破，因此未来要致力于自动、高效的粪便抗原前期处理纯化设备的研发和优化。

粪便Hp核酸的检测从一定程度上规避了粪便抗原检测的一些局限性，细菌核酸相对于蛋白、多糖类抗原更加稳定，不易受粪便中复杂成分的影响，而且核酸的提取和纯化技术成熟，自动化程度高，同时细菌核酸可以在检测工程中进行扩增放大，这样大大提高了检测的敏感性。因此粪便幽门螺杆菌核酸检测是未来Hp检测的一个方向，检测的特异性和灵敏度均较有保障。

目前可用于幽门螺杆菌检测的PCR技术包括逆转录PCR、实时荧光定量PCR 、巢式PCR 、多重PCR 及数字PCR等。PCR技术具有快速、准确和实时等诸多优点，准确率高到95%以上[14]。PCR只需要根据不同用途检测不同的基因，设计不同的引物即可，检测十分方便。16S rRNA主要作为菌株甄别的靶标，从分子水平上确定是否感染幽门螺杆菌。23S rRNA主要是作为耐药基因进行检测，确定菌株是否具有克拉霉素耐药，以为根除疗法提供更为合适的药物组合。

2.3 幽门螺杆菌血清学检测幽门螺杆菌常见的特异性抗原主要包括保守蛋白尿素酶UreA和UreB以及毒力蛋白CagA和VacA，这些抗原分子随着幽门螺杆菌感染可刺激机体产生对应的IgG抗体，因此，可以通过检测受检者血清中针对幽门螺杆菌的相应抗体来辅助诊断幽门螺杆菌感染，在此基础上开发了血清学的检测试剂和检测方法。血清学检测方法可以不受消化道出血、抗生素、PPI等因素的干扰。通常认为，抗体检测无法判断是否为病原体的现症感染，但幽门螺杆菌感染有其特殊性，就是幽门螺杆菌一旦感染，如果没有经过系统、标准化的抗Hp治疗，那么幽门螺杆菌不会自我消除，因此在这种情况下，很多医生认为幽门螺杆菌抗体阳性，如果未接受过治疗，那么就可以认为是现症感染。当然，不建议血清抗体检测用来评估根除治疗效果，因为病原体成功清除后，血清抗体仍然能维持相当长的时间。免疫印迹法和ELISA是目前临床上检测幽门螺杆菌感染的常用血清学方法，试验操作简便、快捷，性价比价高。ELISA用于幽门螺杆菌抗体的检测，特异性和灵敏度均在60%～90%之间，ICT的特异性和灵敏度比ELISA稍好些[15]。除了血液以外，尿液也可以采用ELISA和ICT进行检测，该法更适合儿童感染者。

血清学检测的准确性也容易受到抗原特异性的影响，例如东方型幽门螺杆菌的CagA和西方型幽门螺杆菌的CagA，两者产生的抗体特异性有差异，因此基于西方型幽门螺杆菌抗原的ELISA试剂盒，在检测东方型幽门螺杆菌的感染时准确性往往不高。Doohan团队开发了针对东方型CagA的ELISA试剂盒，较大的提升了产品的灵敏度和特异性[16]。此外，与成人相比，血清学在检测儿童是否感染幽门螺杆菌的准确率更低，Leal等对42个儿童样本进行荟萃分析，结果显示血清lgG抗体的特异性为92%，灵敏度为79%，推测可能是由于儿童对于菌株抗原的免疫应答较成人更晚所致[17]。血清学免疫检测方法还需要考虑待检的菌株的抗原抗体特异性问题，优先选择当地流行株作为抗原制备的目标菌株，并筛选出具有谱系特异性的抗体，提高试剂检测准确度。

血清抗体检测最大的优势在于可以检测幽门螺杆菌毒力蛋白抗体，从而判断受检者感染的幽门螺杆菌是否产生相应的毒力蛋白，从而对幽门螺杆菌毒力及致病力水平做出评价。由于不同毒力水平的幽门螺杆菌导致不同的临床后果，只有少数高毒力的幽门螺杆菌感染才会导致胃炎、消化性溃疡等疾病，而大多数不产生VacA和CagA的幽门螺杆菌感染往往不会重新临床症状，表现为健康带菌者。因此，幽门螺杆菌血清抗体检测有助于细菌毒力水平的判断，从而指导临床采取相应的处理方案，实现幽门螺杆菌相关疾病的精准诊疗。

结语

幽门螺杆菌在全球的平均感染率为50%，中国初步测算约有8亿人感染该菌，对于幽门螺杆菌感染，特别是毒力型幽门螺杆菌感染，根除疗法仍然是临床的首选治疗方案，通过联合抗生素、PPI和秘剂等联合用药，对感染者进行幽门螺杆菌清除治疗。但随着抗生素的广泛使用，耐药菌不断出现，根除率呈现逐年下降的趋势。如今幽门螺杆菌感染对于人类健康的威胁愈发严重，且临床症状的消退并不一定表示幽门螺杆菌被成功清除，精准的检测技术是评价治疗效果的关键。内窥镜下的侵入式检测可以比较准确的对感染情况进行判断，但对于孩童的感染，较难以实施。非侵入式检测方法，包括UBT、血清学检测、PCR无创技术等，在预防检测准确率价高，依从性好，操作简便，逐渐已经成为预防的主流检测方法，但容易受到各种干扰项的影响，在背景不清晰的情况下，容易产生假阴性或者假阳性的检测结果。对于检验人员和受检者的感受而言,一般认为最优选的方法是“无创”、“快速”、“简便”、“准确”的检测方法。临床上，应该根据检测目的不同选择不同的检测方法或者检测方法的组合，尤其应该考虑到当地的流行菌株是否存在特殊性，以及相应的检测方法的优缺点及可操作性。已有诸多研究表明，幽门螺杆菌感染轻则可以诱发浅表性的胃黏膜损伤，进而引发胃窦炎、胃溃疡甚至最终导致胃癌的发生和转移。研究显示成年人的感染可能始于儿童期，且持续感染，感染期越长，致病风险、特别是致癌风险就越高，因此对于幽门螺杆菌感染的及早发现、精准诊疗具有重要意义。我们期待未来有更多的科研工作者能完善和升级现有的技术，开发出更好的技术和产品，为深入研究幽门螺杆菌的致病机理，更加精准地预防和根除幽门螺杆菌感染做出贡献。

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项目名称：体外诊断试剂全生命周期监管技术研究重点实验室（项目编号：2020ZDB10）