酸菜发酵期间细菌群落结构动态变化

酸菜发酵期间细菌群落结构动态变化

彭静

四川道泉老坛酸菜股份有限公司 四川省 成都市 610000

摘要：由于自然发酵的酸菜风味独特，普遍受到了消费者的喜爱和青睐，在生活中是常见的调味菜。生态环境中的乳酸菌和白菜在共同作用下，制作成了发酵酸菜。没有经过杀菌的蔬菜表面存在复杂多样的微生物，容易在发酵过程中引入对人体有害的微生物类群。因此，本文利用形态学和分子生物学对自然发酵酸菜中的微生物多样性进行了分析和研究，以期可以为将来酸菜发酵走向规模化和标准化提供理论基础。

关键词：酸菜发酵；细菌群落结构；动态变化

引言

我国有多种多样的传统发酵食品，包括发酵蔬菜类食品、发酵谷类食品、发酵豆类食品以及其他与发酵相关的肉类制品、乳品和酒类。发酵是人们保存食物的一种传统方法，发酵工艺在无数次的演变和传承下，逐渐形成了我国独特的食品发酵工艺。发酵酸菜是在低浓度食盐的条件下，利用微生物发酵而制成的一种蔬菜食品。酸菜营养丰富且具有独特的风味，同时也具有开胃健脾等生物学功能。酸菜的发酵步骤主要有以下几点：①发酵的前期，以需氧型微生物发酵为主，在发酵进行的过程中，酸菜中的氧气逐渐被消耗成无氧的环境；②发酵中期，以乳酸菌发酵为主要的发酵方式，乳酸菌在这个发酵过程中会产生大量的乳酸，造成发酵液中的pH值快速下降；③以乳酸菌中的短乳酸杆菌发酵为主，形成泡菜中的多种风味物质，这个步骤是泡菜中风味物质形成的关键步骤。之前的一些研究人员在鉴定酸菜微生物时，主要使用的方法是分离和纯化的方法，鉴定酸菜中的微生物，不仅要消耗大量的时间，而且在培养的过程中也容易被环境因素所影响，酸菜中细菌多样性的情况就无法正常地反映出来，影响结果的可靠性[1]。当前，在分子生物技术的发展和进步下，先进的技术和手段有助于分析复杂的微生物群落。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜大白菜；酚酞（均为分析纯）、盐酸萘乙二胺、硼砂、乙酸锌、亚铁氰化钾、亚硝酸钠、氢氧化钠以及对氨基苯磺酸；16SrRNA基因V3～V4区引物合成及检测；DP812土壤基因组脱氧核糖核酸提取试剂盒。

1.2仪器与设备

AL204电子天平；DK-S26电热恒温水浴锅；PHS-3E型pH计；UV-1200型紫外可见分光光度；CRY-2112恒温摇床；ThermoMultiskan1510酶标仪。

1.3试验方法

1.3.1酸菜的操作要点及制作工艺流程

操作要点：挑选新鲜的大白菜，将外层叶片清理掉之后；把白菜帮掰成很多片，并用清水清洗干净；将其在85～90℃的开水中漂烫0.5min（菜帮要先浸烫），取出后再放入冷水中漂；白菜表面水分沥干后，切成均匀细丝宽度在0.5～1cm。在此期间要混匀不同部位的白菜细丝；用30各555mL的矿泉水瓶，分别将350g混匀的白菜丝装入每一瓶中；在瓶中注满1.5%的盐水，拧紧瓶盖，将其放在25℃恒温培养中发酵一段时间，最后就得到了酸菜成品。制作工艺流程如下：挑选新鲜大白菜→清→烫漂→沥水→切丝混匀→装瓶→注盐水→封盖→恒温发酵→酸菜成品。

1.3.2酸菜理化指标的测定

每一瓶酸菜都代表一个独立的时间点，从0h取样测量，每隔12h进行一次取样。首先，在烧杯中倒入瓶内的酸菜与发酵液，并将其全部研磨成匀浆，分别称取酸菜匀浆10g将其作为理化指标的检测样品。①pH值的测定：使用pH计；②亚硝酸盐含量的测定：参照GB5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸萘乙二胺法；③总酸含量的测定：参照GB12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法[2]；④OD600nm值的测定：使用紫外分光光度计测定在波长600nm处的吸光度值；⑤所有试验重复测定3次取取最后的平均值。

1.3.3生物信息学分析

①用Trimmomatic软件和Cutadapt软件过滤初始列的质量；②用Usearch软件和Uchime软件拼接和筛选对列，得到最终有效数据；③用Usearch软件聚类相似度为97.0%的有效列，获得操作分类单元；④使用QIIME2软件进行α多样性分析，用MEGAN软件绘制分类学系统关系树，对样品中菌群的进化关系及两样品在不同分类学分支上列丰度的差异进行比较；⑤使用PICRUSt2软件预测发酵前、后期两个酸菜样本中微生物的基因功能，并将两个样本在不同功能之间存在的差异进行比较[3]。

2、结果与分析

2.1 酸菜样本理化指标及OD600 nm值的检测

酸菜的发酵过程通过p H值可以表现出来，总酸能将酸菜发酵后的酸香味体现出来，OD600 nm值能够反映酸菜中的菌群浓度，亚硝酸盐含量反映了发酵蔬菜的安全性。发酵过程中酸菜的p H值、总酸含量、OD600nm值及亚硝酸盐含量的变化如（图1）所示。

图1 酸菜发酵过程中理化指标及OD600 nm值的变化

由图1可知，p H值在发酵12 h时，下降至4.62，亚硝酸盐含量（9.43 mg/kg）达到峰值，OD600 nm值（0.42）降到最低点，总酸含量（1.35 g/kg）在均匀上升时期。p H值在发酵72 h时，降至3.53，曲线比较平稳；亚硝酸盐含量（2.67 mg/kg）也降到最低点，曲线比较平稳；总酸含量（3.60 g/kg）升至最高点，然后就保持不变。进而可知，整个发酵阶段内理化指标变化明显的时间点就是发酵12 h和72 h，将发酵12 h（发酵前期）对应的样本 名为SC1，发酵72 h（发酵后期）对应的样本 名为SC2。

2.2 酸菜样本中细菌菌群结构分析

细菌菌群在两个酸菜样本中的各分类水平如（表1）所示。由表3可知，酸菜样本SC1中的细菌菌群归属于7个门中的44个属，酸菜样本SC2中的细菌菌群归属于8个门中的42个属，在各分类水平的数量上没有很大的差距。

表1两个酸菜样本细菌菌群的各分类水平统计结果

2.2.1 基于门水平酸菜样本细菌菌群结构的分析

细菌微生物在两个酸菜样本中，在门水平上的菌群结构如（图2）所示。由图2可知，共有9个物种在样本SC1和样本SC2在门分类水平上注释到，共有细菌门藻细菌门、厚菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门、放线菌门。其中，相对丰度变化最大的是Proteobacteria，其发酵前期的相对丰度为5.86%，发酵后期的相对丰度为10.49%，增加了4.63%。发酵前期独有的细菌门为髌骨细菌门（0.01%），发酵后期独有的细菌门为绿弯菌门（0.04%）和酸杆菌门（0.01%）。

图2 基于门水平酸菜样本细菌菌群结构分析结果

2.2.2 基于属水平酸菜样品细菌菌群结构的分析

细菌微生物在两个酸菜样本中，在属水平上的菌群结构如（图3）所示。由图3可知，样本SC1共含有44个细菌属，SC2共含有42个细菌属，样本SC1和SC2均含有魏斯氏菌属、明 珠菌属、乳球菌属、乳杆菌属4种乳酸菌。相比于样本SC1，样本SC2中4种乳酸菌属的相对丰度均存在小幅度下降。其中乳酸菌含量最丰富的是Weissella，相对丰度由发酵前期的26.23%降至发酵后期的25.47%；Leuconostoc的相对丰度由发酵前期的1.46%下降至发酵后期的0.27%；Lacto-coccus的相对丰度由发酵前期的0.60%降至0.41%；Lacto-bacillus的相对丰度由发酵前期的0.26%降至0.14%。除此之外，一些功能细菌在两个样本中都被检测到，其中真杆菌属在样本SC1及SC2中的相对丰度分别为0.003%和0.008%，在两样本中阿克曼菌属的相对丰度分别为0.014%和0.005%。根据研究得知，在调节血脂异常中真杆菌属对具有一定作用，经动物实验以及部分临床试验证明阿克曼菌属有很大的潜力可以作为益生菌剂。综上可知，对于食品功能方面而言，采用本实验工艺制成的酸菜具有一定的优势。

图3 基于属水平酸菜样本细菌菌群结构分析结果

3、结语

营养丰富、风味独特和开胃健脾等都是发酵酸菜的特点。现如今，家庭式小规模生产是酸菜发酵的主要形式，进而存在发酵时间长、产量不稳定等因素。因此，为了人们的健康，本次对自然发酵酸菜中的微生物多样性的研究主要是利用形态学和分子生物学的手段。经过研究得知，在自然发酵的酸菜中，乳酸杆菌的种类占有主导优势，然后就是酵母菌以及芽孢杆菌。

参考文献

[1] 何家乐，吴幻，刘梦绮，等.添加糖和乳酸菌对东北酸菜发酵效果的影响[J].中国调味品，2021，46(5)：22-27，44.

[2] 朱翔，汪冬冬，明建英，等.四川泡菜和东北酸菜在发酵过程中的物质成分变化[J].中国调味品，2021，46(4)：78-81.

[3] 刘晓辉，陈顺，李杨，等.人工接种副干酪乳杆菌生产L-乳酸酸菜条件的研究[J].中国调味品，2020，45(9)：91-94.