无限极（新会）有限公司 江门新会 529100
摘 要：目的：验证灭菌后的取样（检测）工具的贮存有效期限，确保灭菌后的取样（检测）工具在有效期内使用是不会对取样样品造成污染的。方法：按《中华人民共和国药典》2020年版四部【非无菌产品微生物限度检查】1105微生物计数法、GB/T 5750.12—2006生活饮用水标准检验方法微生物指标，将已经过121℃高压蒸汽灭菌15min或160℃高温干热灭菌120min的取样（检测）工具放置各自常用场所贮存，分别对贮存期为7天、14天、21天做灭菌有效性验证，验证项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、总大肠菌群。结果：取样（检测）工具在常用场所贮存21天内均能保持灭菌有效状态。结论：考虑日常使用情况和灭菌成本能耗，综合灭菌效果的质量要求，设定本实验室的取样（检测）工具在灭菌后的贮存有效期为14天，并且在此期间使用该取样（检测）工具不会对取样样品造成二次污染。
关键词：灭菌取样（检测）工具、贮存有效期、验证
食品微生物的检测是食品安全监管中重要的环节之一，要保证微生物检测的准确性和公正性，在样品取样时要做到无菌操作，防止样品被二次污染。取样时，需加强无菌操作的意识保证取样过程做到“无菌”，其中确保取样工具不对取样样品造成二次污染也具有关注的重要意义。现行药品生产质量管理规范、GB 4789.1有对存放样品容器的类型和状态、取样注意事项、取样器具的清洁方法和贮存要求、检验用品应满足微生物检验工作的需求等提出了应当满足的规定，却没有对取样（检测）工具灭菌的贮存有效期进行考究，对其质量要求的描述甚少。所以下面验证过程，是以本实验室为例，对取样（检测）工具的灭菌有效结果进行验证，再确立适宜本实验室取样（检测）工具具体的灭菌有效贮存期。
1 材料与方法
1.1仪器与设备
SPHP E6612-1ED型脉动真空灭菌柜（STERIVAP）、FD240型电热恒温鼓风干燥箱（BINDER）、VS-1300-U型洁净工作台（苏州安泰）、BF400型生化培养箱（BINDER）、MJ-250-Ⅱ型霉菌培养箱（上海一恒）、Galaxy230型菌落计数器（WIGGENS）、MS3 basic迷你振荡器（IKA）、EZ-Fit Manifold微生物过滤系统（Ez-streamTMPump）。
1.2培养基与试剂
（1）0.85%无菌生理盐水，氯化钠AR（广州化学试剂厂）：配制方法为称取氯化钠8.5g，加入1L蒸馏水，加热溶解，分装后121℃灭菌15分钟。
（2）胰酪大豆胨琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）：配制方法为称取本品40g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。
（3）沙氏葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）：配制方法为称取本品65g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。
（4）乳糖蛋白胨培养液（广东环凯微生物科技有限公司）：配制方法为称取本品23g（单料）、或46g（双料），加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌20min。
（5）伊红美蓝琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）：配制方法为称取本品37.5g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，冷至50℃倾注灭菌培养皿。
（6）孔径为0.45μm、直径为50mm的无菌滤膜（MILLIPORE）。
1.3 方法
采用《中华人民共和国药典》2020年版四部【非无菌产品微生物限度检查】1105微生物计数法和GB/T 5750.12—2006生活饮用水标准检验方法微生物指标的标准方法，开展需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、总大肠菌群三个项目的验证实验。
2 验证内容
2.1 取样工具灭菌方式及流转途径
（1）取样瓶：蓝盖瓶或三角瓶（用配套的橡胶塞或瓶盖封口，并以锡箔纸包裹瓶口部分），共准备180个取样瓶，置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌15min。灭菌后的取样瓶会放在微检室灭菌暂存柜、样品室送检柜及车间暂存间三个地方贮存。
（2）不锈钢专用取样器：实验室订制的不锈钢取样器，用牛皮纸包裹，共准备14个不锈钢取样器，置于电热恒风干燥箱160℃灭菌120min。灭菌后的不锈钢取样器会放在样品室送检柜和取样车两个地方贮存。
（3）检测工具不锈钢勺子和塑料滤杯：用灭菌专用塑料袋子装10个/袋，用橡皮筋捆绑袋口，不锈钢勺子和塑料滤杯各共准备8袋，置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌15min。灭菌后的不锈钢勺子和塑料滤杯主要放在微检实验室内供微生物检测使用。
（4）检测工具移液枪的塑料枪头：放在配套的塑料枪头专用盒中10支/盒，灭菌指示带胶纸黏紧开盖处，共准备8盒，
置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌15min。灭菌后的塑料枪头主要放在微检实验室内供微生物检测使用。
2.2 验证实验的制样步骤
随机选取当天同一类别2套已经过灭菌的取样（检测）工具进行灭菌有效性验证实验，而后将相同类别的待检取样（检测）工具于其常用场所各贮存7天、14天、21天后，重复进行灭菌有效性验证实验。
验证实验的制样步骤：（1）取样瓶：用90mL0.85%无菌生理盐水洗脱9个瓶子，样液混匀静置，制成检样A1、A2、A3、A4等，进行过滤。（2）不锈钢专用取样器：用100mL0.85%无菌生理盐水洗脱1个取样器的取样接触面，样液混匀静置，制成检样B1、B2、B3、B4等，进行过滤。（3）不锈钢勺子、塑料滤杯和塑料枪头：以袋（盒）为单位，用100mL0.85%无菌生理盐水洗脱一袋（盒）中10只不锈钢勺子（塑料滤杯/塑料枪头），样液混匀静置，制成检样C1、C2、C3、C4等(或D或E），进行过滤。同步做空白对照实验和阴性对照实验。
2.3 验证项目及结果要求
验证项目：（1）需氧菌总数：倾注胰酪大豆胨琼脂培养基到培养皿中，待其凝固后将过滤好的滤膜放于培养基上于30-35℃，培养3天，进行菌落计数；（2）霉菌和酵母菌总数：倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基到培养皿中，待其凝固后将过滤好的滤膜放于培养基上于20-25℃，培养5天，进行菌落计数；（3）总大肠菌群：各取10 mL样液接种到二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液，共接种5管，于36℃±1℃培养24h±2h，若发酵管产酸产气，则接种于EMB培养基和乳糖蛋白胨培养液进行结果确认，同时做染色镜检。
结果要求：其验证项目需氧菌总数的结果要求：<1 cfu>mL，霉菌和酵母菌总数的结果要求：<1 cfu>
2.4 验证结果
（1）取样瓶
检验日期 | 存放位置 | 检样/9个 | 验证项目 | 判断 | ||
需氧菌 总数（CFU/mL) | 霉菌和酵母菌总数（CFU/mL) | 总大肠菌群（MPN/100mL) | ||||
当天灭菌后 | / | 检样A1 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样A2 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌7天后 | 微检室灭菌暂存柜 | 检样A3 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样A4 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
样品室 送检柜 | 检样A5 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样A6 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
车间 暂存室 | 检样A7 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样A8 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌14天后 | 微检室灭菌暂存柜 | 检样A9 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样A10 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
样品室 送检柜 | 检样A11 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样A12 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
车间 暂存室 | 检样A13 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样A14 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌21天后 | 微检室灭菌暂存柜 | 检样A15 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样A16 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
样品室 送检柜 | 检样A17 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样A18 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
车间 暂存室 | 检样A19 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样A20 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
标准 | <1 | <1 | 不得检出 | |||
（2）不锈钢专用取样器
检验日期 | 存放地 | 样品/个 | 验证项目 | 判断 | ||
需氧菌 总数（CFU/mL) | 霉菌和酵母菌总数（CFU/mL) | 总大肠菌群（MPN/100mL) | ||||
当天灭菌后 | / | 检样B1 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样B2 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌7天后 | 样品室 送检柜 | 检样B3 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样B4 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
取样车 | 检样B5 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样B6 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌14天后 | 样品室 送检柜 | 检样B7 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样B8 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
取样车 | 检样B9 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
检样B10 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌21天后 | 样品室 送检柜 | 取样器B11 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
取样器B12 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
取样车 | 取样器B13 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | |
取样器B14 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
标准 | <1 | <1 | 不得检出 | |||
（3）不锈钢勺子
检验日期 | 存放地 | 样品/袋 | 验证项目 | 判断 | ||
需氧菌 总数（CFU/mL) | 霉菌和酵母菌总数（CFU/mL) | 总大肠菌群（MPN/100mL) | ||||
当天灭菌后 | / | 检样C1 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样C2 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌7天后 | 微检实验室 | 检样C3 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样C4 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌14天后 | 微检实验室 | 检样C5 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样C6 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌21天后 | 微检实验室 | 检样C7 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样C8 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
标准 | <1 | <1 | 不得检出 | |||
（4）塑料枪头
检验日期 | 存放地 | 样品/盒 | 验证项目 | 判断 | ||
需氧菌 总数（CFU/mL) | 霉菌和酵母菌总数（CFU/mL) | 总大肠菌群（MPN/100mL) | ||||
当天灭菌后 | / | 检样D1 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样D2 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌7天后 | 微检实验室 | 检样D3 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样D4 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌14天后 | 微检实验室 | 检样D5 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样D6 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌21天后 | 微检实验室 | 检样D7 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样D8 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
标准 | <1 | <1 | 不得检出 | |||
（5）塑料滤杯
检验日期 | 存放地 | 样品/袋 | 验证项目 | 判断 | ||
需氧菌 总数（CFU/mL) | 霉菌和酵母菌总数（CFU/mL) | 总大肠菌群（MPN/100mL) | ||||
当天灭菌后 | / | 检样E1 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样E2 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌7天后 | 微检实验室 | 检样E3 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样E4 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌14天后 | 微检实验室 | 检样E5 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样E6 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
灭菌21天后 | 微检实验室 | 检样E7 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 |
检样E8 | <1 | <1 | 未检出 | 合格 | ||
标准 | <1 | <1 | 不得检出 | |||
备注：空白对照实验和阴性对照实验的结果均符合验证结果要求。
2.6 数据分析
（1）121℃高压蒸汽灭菌15min和160℃高温干燥灭菌120min后的取样（检测）工具，经验证，当天是符合灭菌效果的。
（2）灭菌后的取样（检测）工具分别于其常用场所贮存7天、14天、21天后，经验证，也能达到灭菌合格要求。
（3）综合取样工具的日常使用情况和灭菌成本能耗，建议将这些灭菌后的取样（检测）工具的灭菌有效贮存期设定为14天。
3 结论
对取样（检测）工具的灭菌有效贮存期进行探究，使其在贮存期内保持“无菌”的效果，不影响取样后的样品保存水平，从每天“现灭现用”转换为在贮存期内使用，降低灭菌成本能耗，提高效益。整个验证过程也可为验证各类取样、检测、贮存工具的灭菌贮存期提供有效参考的验证方案。
参考文献
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4．《中华人民共和国药典》【非无菌产品微生物限度检查】1105微生物计数法：2020年版四部[S].
5．《生活饮用水标准检验方法微生物指标》：GB/T 5750.12—2006[S].
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7．消毒器械灭菌效果评价方法：GB/T 15981-2021[S].
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